本发明属于生物碳点制备技术领域，具体涉及一种用于荧光影像成像的碳点、制备方法及应用。
背景技术：
碳点作为一种新生的纳米材料，被广泛应用于生物科学和临床医学中，尤其是其荧光性质，以及可以通过细胞的胞吞作用进入细胞的特性，碳点在细胞影像的方面的作用尤为突出。碳点在一定的范围内具有激发依赖性，也就是，其发射波长随着激发波长的红移而红移，这也是判断其是否为碳点的条件之一。与其他荧光纳米粒子相比，碳点具有低毒性、荧光性能稳定和生物形容性好等特点，这些特点也就意味着其更适合应用于生物科学以及临床医学方面。
目前碳点的合成方法种类繁多，有激光烧蚀法、电化学法、水热法、微波法和热解法等，而水热法合成碳点一般产率较高，而且制备工艺简单，实验设备要求低，是目前采用比较多的一种制备方法。
然而现有的碳点制备方法存在成本高、不环保或原料难以得到的缺陷，所以发展简单易行、成本低廉，并且不污染环境的碳点势在必行。
技术实现要素：
本发明提供的一种用于荧光影像成像的碳点、制备方法及应用，解决了现有的碳点制备方法存在成本高、不环保或原料难以得到的问题。
本发明提供了一种用于荧光影像成像的碳点的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将4-羟乙基哌嗪乙磺酸、双氧水和超纯水按照2:1:8的质量比例混合均匀，得到原料混合物溶液；
步骤2，将所述原料混合物溶液置于高压反应釜中，180℃加热18-20h，得到反应混合物溶液；
步骤3，将反应混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量为500da，加入超纯水，透析24-28h，然后将透析袋外面的溶液旋转蒸发浓缩至除去水分，得到碳点粗油状液体；
步骤4，将碳点粗油状液体溶于等同质量的甲醇中后，经硅胶柱纯化，得到纯化液，然后将纯化液旋转蒸发浓缩至除去甲醇，得到纯化油状液体；
步骤5，向步骤4的纯化油状液体中加入甲醇，产生沉淀，然后离心，收集上清液，得到用于荧光影像成像的碳点。
优选的，上述用于荧光影像成像的碳点的制备方法中，步骤2中，高压反应釜的压力小于或等于3mpa。
优选的，上述用于荧光影像成像的碳点的制备方法中，步骤4中，硅胶柱纯化的具体步骤为：将碳点粗油状液体溶于等同质量的甲醇后，得到粗溶液；然后以甲醇作为展开剂过硅胶柱对粗溶液进行纯化，得到纯化液，其中硅胶柱中填充的是300目的硅胶，硅胶柱的外直径为26mm，高度为10cm。
优选的，上述用于荧光影像成像的碳点的制备方法中，步骤5中加入的甲醇的体积是步骤3中的反应混合物溶液体积的10倍。
优选的，上述用于荧光影像成像的碳点的制备方法中，步骤5中离心的条件为4℃，5000g，5min。
本发明还提供了一种上述制备方法制备而成的用于荧光影像成像的碳点。
本发明还提供了一种上述碳点在细胞荧光影像成像中的应用。
本发明还提供了一种上述碳点作为脑部肿瘤的荧光探针的应用。
与现有技术相比，本发明的荧光碳点具有以下有益效果：
(1)利用生活中常见的材料，原料成本低廉，合成的工艺简单，生物相容性好，可大量制备；
(2)此碳点水溶性好，在水中分散性好，适于用于细胞荧光影像成像，在生物科学和临床医学方面的前景非常广阔；
(3)碳点本身的发射波长随激发波长的红移而红移；
(4)现有碳点的尺寸较大，而本发明的碳点尺寸较小，直径在2-3nm左右，并且可以轻松透过截留分子量为500da的透析袋，有望突破脑血屏障，作为脑部肿瘤的荧光探针。
附图说明
图1为碳点在透射电子显微镜下的整体形貌图；
图2为碳点粒径分布的柱状图；
图3为碳点的荧光光谱图；
图4为碳点的激发波长依赖性测试图；
图5为碳点在酵母细胞中的荧光影像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明提供的一种用于荧光影像成像的碳点，包括以下实施例：
实施例1
一种用于荧光影像成像的碳点，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将2g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1g的双氧水和8g的超纯水混合均匀，得到原料混合物溶液；
步骤2，将5g原料混合物溶液置于高压反应釜中，高压反应釜的压力小于或等于3mpa，180℃加热18h，得到反应混合物溶液；
步骤3，将5ml反应混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量为500da，加入400ml的超纯水，透析24h，然后将透析袋外面的溶液旋转蒸发浓缩至除去水分，得到碳点粗油状液体；
步骤4，将1g碳点粗溶于1g甲醇中后，得到粗溶液；然后以甲醇作为展开剂过硅胶柱对粗溶液进行纯化，得到纯化液，其中硅胶柱中填充的是300目的硅胶，硅胶柱的外直径为26mm，高度为10cm；最后将纯化液旋转蒸发浓缩至除去甲醇，得到纯化油状液体。
步骤5，向步骤4的纯化油状液体中加入50ml甲醇，产生沉淀，然后离心，离心的条件为4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反应的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用于荧光影像成像的碳点，低温避光保存备用。
实施例2
一种用于荧光影像成像的碳点，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将4g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2g的双氧水和16g的超纯水混合均匀，得到原料混合物溶液；
步骤2，将5g原料混合物溶液置于高压反应釜中，高压反应釜的压力小于或等于3mpa，180℃加热20h，得到反应混合物溶液；
步骤3，将5ml反应混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量为500da，加入400ml的超纯水，透析26h，然后将透析袋外面的溶液旋转蒸发浓缩至除去水分，得到碳点粗油状液体；
步骤4，将1g碳点粗溶于1mg甲醇中后，得到粗溶液；然后以甲醇作为展开剂过硅胶柱对粗溶液进行纯化，得到纯化液，其中硅胶柱中填充的是300目的硅胶，硅胶柱的外直径为26mm，高度为10cm；最后将纯化液旋转蒸发浓缩至除去甲醇，得到纯化油状液体。
步骤5，向步骤4的纯化油状液体中加入50ml甲醇，产生沉淀，然后离心，离心的条件为4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反应的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用于荧光影像成像的碳点，低温避光保存备用。
需要说明的是，上述本发明的制备方法及实施例1-2中，制备的碳点可以直接将液体于4℃保存半年，或者冻干成粉末后-20℃长期保存。
我们利用透射电子显微镜观察制备而成的碳点，结果如图1所示，由图1可知，碳点的形状均为球形，且碳点在水中分散性好。
测量不同碳点的颗粒直径，碳点粒径分布的柱状图如图2所示，颗粒直径在1-3nm之间，且2-3nm大小的碳点颗粒占所有碳点颗粒的60％左右，在1-3nm之间，颗粒直径均一，有望突破脑血屏障。
另外，我们在激发波长为370nm，发射波长为460nm的条件下，检测碳点的荧光特性，结果如图3所示，从图3中可观察到明显的峰值，说明激发波长为370nm，发射波长为460nm的条件下，本发明的碳点呈现良好的荧光特性。
进一步的，我们分别在激发波长为320-430nm(激发波长间距为10nm)的条件下，测定碳点的荧光光谱，结果如图4所示，由图4可以看出，同其他碳点一样，在激发光为320-430nm的范围内，发射波长随激发光的红移而红移，而且随着激发光波长的红移，荧光强度先增加后降低，在370nm激发下荧光强度最大且发射波长为460nm。
进一步的，为了验证本发明提供的碳点能够在细胞荧光影像成像中的应用，我们以酵母细胞为作用对象，具体步骤如下：
酵母菌在ypd培养基中30℃孵育17h，od600值调整到1，取1ml菌液离心收集酵母细胞，弃去上清，100μlypd培养基重悬酵母细胞，并加入碳点(碳点的终浓度为0.1mg/ml)，30℃继续孵育6h，用pbs缓冲溶液清洗酵母细胞3次，制样，得到待检测酵母细胞，测荧光显微镜。
以370nm的紫外光为激发光，然后在显微镜下观察待检测酵母细胞的细胞形态和荧光散发情况，结果如图5所示，从图5我们可以看出，碳点可以成功的转入酵母细胞中，并具有显著的荧光效果，可以用于细胞影响检测。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。