一种从桂花果皮中提取黑色素的方法及其应用与流程

本发明涉及植物黑色素生产技术领域，具体涉及一种从桂花果皮中提取黑色素的方法及其应用。

背景技术：

黑色素通常为无定型非均匀性的大分子物质，其组成不仅与单体单元有关，而且还与聚合过程中的环境条件有关。黑色素除作为色素外，其本身还具有多种生物功能，如：为生物体提供结构性强度；抗辐射；对光受体产生屏蔽，且具有维持体温平衡的作用；作为化学保护色素行使功能，保护生物体免受抗生素或其他药物以及重金属等有毒物质的伤害；可对能量进行吸收、保持、储存和转换。

桂花又名木犀、岩桂、九里香、金粟。属于木犀科、木犀属(桂花属)，是一种绿化、美化和香化三者密切结合,观赏和实用兼备的优质园林树种,是我国著名的芳香植物。桂花除供观赏、美食外,根、花、种子和果实都可药用除病,性温、味辛、无毒,有化痰、散淤、健脾益肾、舒筋活络的功能。相关研究报道桂花果皮中含有黑色素，但对桂花果皮中黑色素的提取研究较少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的实施例提供了一种从桂花果皮中提取黑色素的方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明的实施例采用的技术方案是，一种从桂花果皮中提取黑色素的方法，包括以下步骤：

(1)将干净的桂花果皮用微波干燥8～10min，粉碎，过80～120目，得细粉；

(2)微波碱溶液浸提：取碱性水溶液与上述桂花果皮的细粉按体积/重量比(10～50):1在微波下辐射，经微波辐射后的溶液进行水浴提取得提取液；

(3)离心分离：将所得提取液经双层纱布粗滤，然后经相对离心力15000g～20000g离心分离15min～20min得上清液；取所述上清液加入稀盐酸调节溶液ph值，常温下静置12h～24h后经相对离心力3000g～5000g离心分离10min～20min得沉淀；

(4)水解：将所述沉淀用浓盐酸水解，经相对离心力3000g～5000g离心分离10min～20min后收集黑色素粗提物；

(5)洗涤：将得到的黑色素粗提物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯和95％乙醇洗涤，每种溶剂洗涤三次，每次溶剂用量为黑色素粗提物体积的20～50倍；

(6)溶解：取洗涤后的黑色素粗提物用碱溶液超声辅助溶解，碱溶液用量为黑色素粗提物的50倍～100倍，溶解后的黑色素溶液经相对离心力为15000g～20000g离心分离15min～20min得黑色素上清液；

(7)酸化：取所述黑色素上清液进行酸化沉淀，然后取沉淀向其中加入碱溶液调节ph值为ph＝9.0±0.1或ph＝11.0±0.1，再向其中加入稀盐酸调节ph值酸化沉淀，对沉淀进行反复溶解沉淀直至上清液无色后静置离心得到沉淀物，将得到的沉淀物于烘箱中用40℃～60℃烘干得黑色素干粉；

(8)酸解：将得到的黑色素干粉在2mol/l的hcl于100℃的烘箱中酸解6h～12h，离心得黑色素沉淀物；

(9)洗涤除去cl^-：用去离子水反复洗涤黑色素沉淀物，除去其中的cl^-直至cl^-定性检测为阴性为止；

(10)冷冻干燥，将洗净后的黑色素沉淀物置于冷冻干燥机中，于-45℃～-55℃下进行冷冻干燥24～48h得黑色素纯品。

优选地，所述碱溶液为0.1mol/l～2.0mol/lnaoh、0.1mol/l～2.0mol/lkoh或20％的氨水溶液。

优选地，步骤(2)中，微波辐射的功率为600w～800w，时间为80s～120s；碱溶液浸提时间为0.5h～2h，水浴温度为20℃～60℃。

优选地，步骤(3)、(7)中，稀盐酸调节溶液的ph值为ph＝1.0±0.1或ph＝2.0±0.1。

优选地，步骤(4)中，所述浓盐酸水解时间2h～6h，温度98℃～100℃。

本发明实施例还提供所述提取方法的黑色素的应用。

本发明实施例还提供了一种黑色素染发剂，由黑色素、乙醇、聚乙二醇、瓜尔胶、硫酸亚铁、去离子水、丙二醇和ph值调节剂组成。

与相关技术比较，本发明实施例提供的技术方案的有益效果是，本发明实施例的桂花果皮提取黑色素的方法操作简单，提取的黑色素含量和纯度较高，稳定性高，氧化程度低，提取周期短，适合用于桂花果皮黑色素的大量提取，可应用在食品中，提高了桂花深加工的经济价值。

附图说明

图1是本发明实施例制备方法流程示意图；

图2是本发明实施例黑色素染发剂的吸光度随ph值变化变化示意图；

图3是本发明实施例黑色素染发剂染发后吸光度随洗涤次数的变化示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。

请参考图1，一种从桂花果皮中提取黑色素的方法，包括以下步骤：

(1)将干净的桂花果皮用微波干燥8～10min，粉碎，过80～120目，得细粉；微波干燥的桂花果皮可有效的改善桂花果皮的水分迁移条件，驱使水分流向表面，提高干燥速度，从而缩短干燥时间，同时还可有效保持桂花果皮的色泽不受损，有利于提高桂花果皮提取物的品质；

(2)微波碱溶液浸提：取碱性水溶液与上述桂花果皮的细粉按体积/重量比(10～50):1在微波下辐射，将微波辐射后的溶液于水浴中提取得提取液；微波辐射的功率为600w～800w，时间为80s～120s；碱溶液浸提时间为0.5h～2h，水浴温度为20℃～60℃；粉碎后的桂花果皮粉末可提高浸提的效率，微波辐射下加快溶液内部受热可提高提取效率和提取物的稳定性，可缩短水浴提取时间；

(3)离心分离：将所得提取液经双层纱布粗滤，然后经相对离心力15000g～20000g离心分离15min～20min得上清液，提取后的细渣经粗滤和离心之后去除；取所述上清液加入稀盐酸调节溶液ph值，常温下静置12h～24h后经相对离心力3000g～5000g离心分离10min～20min得沉淀，过滤细渣后的提取液在酸性条件下黑色素沉淀离心得到初步的黑色素提取物；稀盐酸调节溶液的ph值为ph＝1.0±0.1或ph＝2.0±0.1；

(4)水解：将所述沉淀用浓盐酸水解，经相对离心力3000g～5000g离心分离10min～20min后收集黑色素粗提物；浓盐酸水解时间2h～6h，温度98℃～100℃；

(5)洗涤：将得到的黑色素粗提物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯和95％乙醇洗涤，每种溶剂洗涤三次，每次溶剂用量为黑色素粗提物体积的20～50倍；将黑色素粗提物表面附着的物质在有机溶剂中溶解去除；

(6)溶解：取洗涤后的黑色素粗提物用碱溶液超声辅助溶解，碱溶液用量为黑色素粗提物的50倍～100倍，溶解后的黑色素溶液经相对离心力为15000g～20000g离心分离15min～20min得黑色素上清液，除去未溶解的部分；

(7)酸化：取所述黑色素上清液进行酸化沉淀，然后取沉淀向其中加入碱溶液调节ph值为ph＝9.0±0.1或ph＝11.0±0.1，再向其中加入稀盐酸调节ph值酸化沉淀，对沉淀进行反复溶解沉淀直至上清液无色后静置离心得到沉淀物，将黑色素洗净，将得到的沉淀物于烘箱中用40℃～60℃烘干得黑色素干粉；

(8)酸解：将得到的黑色素干粉在2mol/l的hcl于100℃的烘箱中酸解6h～12h，离心得黑色素沉淀物；

(9)洗涤除去cl^-：用去离子水反复洗涤黑色素沉淀物，除去其中的cl^-直至cl^-定性检测为阴性为止；采用ag⁺鉴定cl^-是否完全洗净去除；

(10)冷冻干燥，将洗净后的黑色素沉淀物置于冷冻干燥机中，于-45℃～-55℃下进行冷冻干燥24～48h得黑色素纯品。采用冷冻干燥可保持得到的黑色素纯品的性状稳定。

本发明实施例的方法制备的黑色素外观呈棕黑色，在波长为236nm处呈现典型吸收峰；几乎不溶于水和常见的有机溶液，如：正丁醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙酸、乙醚、正己烷、丙酮等，也不溶于植物油；其色价为e1％1cm236nm＝52.1。

实施例二

采用本发明实施例一的方法取桂花果皮进行黑色素提取，包括以下步骤：

(1)将干净的桂花果皮用微波干燥9min，粉碎，过100目筛，得细粉；

(2)取5.0g桂花果皮细粉放入150ml锥形瓶中，加入50ml20％的氨水溶液，经微波700w辐射提取100s，将提取后的三角瓶放入60℃水浴中反应1.5小时后取出，冷却提取液；

(3)将所述提取液用双层纱布粗滤，取滤液经15000g的相对离心力离心15分钟得上清液，向所述上清液加入50ml去离子水混匀，以1mol/l盐酸调节ph值为1～2，静置24小时，使黑色素完全沉淀，经5000g的相对离心力离心15分钟得黑色素粗提物沉淀；

(4)将所述黑色素粗提物沉淀用6mol/l盐酸水解，100℃水解2小时，经5000g相对离心力离心10分钟得黑色素颗粒；

(5)将得到的黑色素颗粒依次用三氯甲烷、乙酸乙酯和95％乙醇反复洗涤，将黑色素颗粒与约50ml溶剂混合震荡20分钟，然后离心分离，每种溶剂洗涤三次；

(6)取洗涤后黑色素颗粒用20％氨水溶液超声波辅助溶解30分钟，经15000g相对离心力离心15分钟得上清液；

(7)取所述上清液用1mol/l的hcl溶液调节至ph为1～2，使之沉淀，经5000g相对离心力离心15分钟，如此反复溶解和沉淀数次，直至上清液无色，沉淀于烘箱中用60℃烘干得黑色素干粉；

(8)取所述的黑色素干粉2mol/l的hcl于100℃的烘箱中酸解12小时，离心，得黑色素沉淀物；

(9)将黑色素沉淀物用去离子水反复洗涤直至除去其中的cl^-；

(10)将洗净后的黑色素沉淀置于冷冻干燥机中，于-50℃下进行冷冻干燥36h得黑色素纯品。

本发明实施例的方法制备的黑色素粉末呈现棕黑色，溶于碱性溶液，不溶于水或常见的有机溶剂。在100℃以下稳定性良好；ph值对桂花黑色素稳定性的影响较小；抗氧化性强；各种金属离子对其稳定性的影响较小；糖、氨基酸、有机酸对桂花果皮黑色素稳定性无明显影响，且具有一定增色作用，即该黑色素适用于大多数食品，其耐盐性强，纯度高。在紫外可见光区最大吸收峰波长为236nm；本发明制备黑色素有较多的芳环结构和较少的烷烃结构，在红外光谱谱图1600cm^-1和1500cm^-1附近有芳环的骨架震动引起的较强的吸收峰；而反映烷烃结构的c-h吸(2930～2830cm)存在相对较弱的吸收峰；(2)红外光谱谱图3400cm^-1附近都存在着强的吸收峰，表明黑色素中含有-oh、-nh或-cooh结构。

取本发明实施例的方法从桂花果皮中提取的黑色素配制黑色素溶液，取黑色素0.1g溶于0.5mol/l氨水中(溶液控制在10ml内)将其配制成ph＝9.0的溶液，放在60℃下的烘箱中静置24h，直至不再有氨气分子逸出为止，然后将溶解的黑色素配制成20ug/ml的黑色素溶液分别进行温度、ph值、氧化剂/还原剂、金属离子、糖/氨基酸/有机酸、耐盐性实验测试。

1.温度对本发明实施例的方法制备的黑色素的影响

将浓度为20ug/ml的黑色素溶液分别置于25℃、50℃、80℃、100℃环境下，间隔1h取出后快速冷却至室温，在最大吸收波长236nm处检测abs值，温度对黑色素的影响见表1。

表1温度对本发明实施例制备的黑色素的影响

由表1可知，本发明实施例制备的黑色素的abs值在100℃以下基本不变化，在误差范围内降解为0，目测色素溶液颜色无变化，从而表明桂花果皮中提取的黑色素在不同温度下热稳定好。

2.ph值对本发明实施例的方法制备的黑色素的影响

分别用hcl、naoh溶液调节上述制备的20ug/ml的黑色素溶液的ph值分别为2、3、4、6、8、10、12和13，放置20min，在波长190―600nm范围内用mv-1800紫外可见光光度计进行光谱扫描，峰值检出并记录色素色泽变化，ph值对黑色素的见表2。

表2ph值对本发明实施例制备的黑色素的稳定性影响

植物色素一般受ph值的影响较明显，随着ph值的变化，色素分子中的-oh、-c＝o-、-o-等基团在h+或oh^－的作用下，发生亲核或亲电重排反应，色素分子将会发生相应的结构变化，从而导致颜色的变化。当变化量到达一定浓度时，将会外呈现稳定的影响，这就是植物呈现不同颜色的根本原因。

由表2可知，不同ph值下的酸碱环境对本发明黑色素最大吸收波长和稳定性影响较大。当ph＝2～7.5时，最大吸收峰产生蓝移现象；当ph＝7.5～13时，最大吸收峰产生红移现象；在酸性条件下吸光度较大，在碱性条件下吸光度较小，表明黑色素在不同ph环境基团发生了转变，使得abs值变化。

3.氧化剂/还原剂对本发明实施例的方法制备的黑色素的影响

3.1氧化剂的影响

取20ug/ml的桂花果皮黑色素水溶液4ml分别加到不同体积的1.25㎎/lkmno4、1.25㎎/lk2cr2o7、3％h2o2中，摇匀，在最大吸收波236nm长处测其abs值，结果见表3。

3.2还原剂的影响

取相同规格的试管5支，分别加入10ml20ug/ml的黑色素溶液，向5支试管中分别加入0.01g、0.02g、0.05g、0.10g、0.15gna2so3，摇匀，在最大吸收波长236nm处测其abs值，结果见表4。

表3氧化剂对黑色素的稳定性影响

由表3可见，不同浓度的kmno4，k2cr2o7，3％h2o2，随其浓度增加，吸光度值越小，色素有不同程度的破坏。长期放置均变为无色，说明kmno4，k2cr2o7，3％h2o2对桂花果皮黑色素都有漂白作用，或者说该黑色素结构单元有易被氧化的部分。

表4不同量还原剂(na2so3)时本发明黑色素稳定性的影响

由表4可见，不同量的na2so3对桂花果皮黑色素的吸光度影响不明显，可见桂花果皮黑色素在还原剂中比较稳定。

4.金属离子对本发明实施例的方法制备的黑色素的影响

分别配制浓度30㎎/lcuso4、mgso4、cacl2、na2so4、fecl3、alcl3和zncl2溶液，取相同规格的试管7支，分别向试管中加入10ml浓度为20ug/ml的桂花果皮黑色素溶液，取所述金属离子溶液0.2ml分别加入所述试管中，在最大吸收波长236nm处测定金属离子色素溶液的abs值。

表5金属离子对黑色素稳定性影响

由表5可知，本发明实施例制备的黑色素对七种金属离子的反应各不相同，但均具有一定的强保色能力。

5.糖/氨基酸/有机酸对本发明实施例的方法制备的黑色素的影响

将糖(蔗糖和葡萄糖)、氨基酸(l―缬氨酸)、有机酸(柠檬酸)配制比例为1：100(g)的水溶液，各取6ml分别加入浓度为20ug/ml的桂花果皮黑色素溶液2ml，于室温每30min测一次abs值。

表6糖、氨基酸、有机酸黑色素稳定性影响

由表6可见，氨基酸(l―缬氨酸)、有机酸(柠檬酸)、蔗糖和葡萄糖对桂花果皮黑色素稳定性无影响，且均有一定的增色作用，因此本发明实施例采用桂花果皮中提取的黑色素可应用于食品中。

6.本发明实施例的方法制备的黑色素的耐盐性

在3只试管中，分别加入0.025g，0.05g，0.125g食盐，再加浓度为20ug/ml的桂花果皮黑色素溶液5ml，摇匀，测定吸光度。

表7本发明黑色素耐盐性结果

由表7结果表明，本发明实施例桂花果皮中提取的黑色素对nacl这种食品基质的稳定性很好。

7.本发明实施例的方法制备的黑色素色价标定

采用全国食品添加剂标准化技术委员会的规定天然着色剂均用具体操作步骤：称取0.2g本发明实施例从桂花果皮中提取的黑色素溶解，然后用蒸馏水稀释定容至100ml，再取1ml稀释定容至100ml，用1cm比色皿，tu―1800紫外可见光光度计，用蒸馏水作参比液，波长为236nm下测定吸光度。要求溶液浓度测定吸光度在0.2―0.7之间一定浓度的吸光度表示。一般多用1wt％、1cm比色皿，在最大吸收峰(236nm)测定吸光度。

测得吸光度a＝0.521，色价＝e1％1cm236nm＝a×100/w＝52.1，而一般的色素色价也是在45.0左右，则说明本发明所述制备方法提取桂花果皮黑色素含量和纯度均较高。

实施例三

本发明实施例还提供了采用实施例一、二的方法提取的黑色素的应用。

本发明实施例还提供了一种黑色素染发剂，由黑色素、乙醇、聚乙二醇、瓜尔胶、硫酸亚铁、去离子水、丙二醇和ph调节剂组成。调节染发剂的ph值为中性，并进行黑色素染发剂的稳定性测试，分别包括温度、ph值及光照时间对黑色素染发剂稳定性的测试。

分别取6份等量黑色素染发剂分别置于20、30、40、50、60、70℃真空干燥箱中加热，以0.5h为时间间隔，取出快速冷却至室温，通过测量abs值计算不同温度及受热时间下黑色素染发剂的热降解的程度，结果见8。

表8不同温度及不同受热时间下染发剂的吸光度值

从表8可知，该染发剂的吸光度在80℃以下基本没有变化，染发剂的颜色、性质也基本没有变化，说明该染发剂的耐热性良好；在染头发的过程中，有冷染和温染两种方式：冷染是在常温下，将染发剂涂于头发上进行染发，温染是在高温下进行染发，温度范围一般在40℃至70℃之间。由表可见，在高温下该染发剂也能保持良好的稳定性，因此不会影响染发效果。

分别取7份等量黑色素染发剂以1mol/lhcl和1mol/lnaoh溶液调节至ph值分别为4、5、6、7、8、9、10，常温下放置1.5h，测量abs值。

参照附图2，随着ph值的增大，黑色素染发剂的吸光度逐渐增大，说明该染发剂在碱性条件下能稳定存在；该染发剂的原料黑色素溶于碱性条件；洗发剂一般都是偏碱性的，因此在洗头发的过程中，该染发剂仍能保持较好的稳定性。

分别取3份等量将黑色素染发剂分别在紫外光、自然光、暗处条件下处理，一段时间后(第1天、第3天、第5天)测量abs值，见表9。

表9光照对黑色素染发剂稳定性的影响

从表9可知，染发剂在紫外光、自然光、暗处三种条件下放置一段时间后，其吸光度值变化很小，这表明该染发剂耐光性良好。人们经常暴露在光照或夏天强烈的紫外线环境下，由表已知，该染发剂耐光性良好，因此本发明实施例的黑色素染发剂上染到头发上后，在这些环境条件下都能保持稳定，不会褪色而影响染发效果。

分别从洗涤次数、染发温度、染发ph值及染发时间进行黑色素染发剂染发稳定性的测试。

参照附图3，对采用黑色素染发剂染色的头发进行洗涤，随着洗涤次数的增加，溶液的吸光度逐渐减小，并且前几次洗涤后的洗涤液的吸光度变化较大，逐渐减小直至不变，表明前几次洗涤可洗脱多余的染发剂，最后趋于稳定；从洗涤后洗涤液的颜色也可观察到，第1、2次洗涤液颜色较深，洗涤后的洗涤液的颜色逐渐变浅直至无色，而被染色的头发在前几次洗涤中颜色几乎无变化，染色较为牢固。

本发明实施例的黑色素染发剂在上染头发时，随着温度的升高，头发颜色越深，染发效果逐渐加强；由于温度较高有利于毛发鳞片的进一步打开，这也使得黑色素等大分子能更顺利地进入头发内部而使头发颜色加深，但温度如果过高，会破坏头发分子结构，使头发纤维失水而导致头发干枯易断[14]，而温度过低，染发剂无法充分渗入毛发内部，上色率较低；选择50℃作为染发的最佳温度。

本发明实施例的黑色素染发剂在上染头发时，黑色素染发剂本身的ph值增大，会增加头发色泽；在碱性条件下头发易膨胀，头发纤维主链断裂外，还可以使横向连接产生变化，使二硫键、离子键等断裂形成新键，黑色素能进入到头发内部；而当碱性过强时，头发会受到损伤，毛发纤维会变得粗糙、干燥、没有光泽、韧度下降；因此染发剂碱性不能过强，黑色素染发剂的ph值控制在7-8范围内，既达到染发的效果也不使头发头皮受到伤害。

本发明实施例的黑色素染发剂在上染头发时，随着染色时间的增加，染色效果增加，染色时间为30min时，头发几乎没有上色，60min时头发颜色偏浅黑，随着时间进一步延长，头发颜色逐渐变成黑色，染色120min后头发颜色光泽无明显变化；因此，黑色素染发剂染发时间优选为2h。

在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。