一种近红外荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及近红外荧光探针技术领域，具体涉及一种可用于内质网靶向的近红外荧光探针及其制备方法和其在内质网靶向生物传感领域的应用。

背景技术：

细胞器是细胞内具有特定结构和功能的亚结构，主要有线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、叶绿体、中心体、核糖体等，他们为细胞内各种生化反应提供场所，在细胞呼吸、遗传、物质合成等生理过程中发挥着重要的作用。其中，内质网普遍存在于除哺乳动物成熟红细胞外的所有真核细胞中，是由单层膜连接而成的网状结构。内质网构成细胞质的膜系统，外与细胞膜相连，内与核孔复合体相通，能有效增加细胞内的膜面积，主要功能是参与蛋白质的合成、修饰、膜脂的合成及细胞钙离子稳态调剂等过程，还与细胞病变、坏死等过程息息相关。因此，设计能够检测内质网中各个生理过程和各种物质稳态的生物化学传感器是当前生物化学领域的重要课题。

近红外荧光染料是一类性能良好的功能性染料，在近红外光区有很好的吸收，在无线电射频识别、肿瘤治疗、太阳能电池、印刷防伪等领域有广泛的应用。用于生物成像时，除了具有近红外吸收、发射波长、还具有良好的水溶性和较低的生物毒性，特异的组织或细胞靶向性以及良好的细胞穿透性等，从而达到更安全、高效、灵敏的荧光成像目的；近红外荧光染料也可以作为一种辅助手段修饰到药物或药物载体的表面，通过荧光成像的方法追踪并检测药物在体内的运输、释放、分布，使这些过程可视化并利于进行控制。

近红外荧光染料包括菁染料类、罗丹明类、方酸类、卟啉类和BODIPY类，其中，菁染料(聚甲川菁染料)是一类优良的荧光染料，由奇数个碳原子组成共振次甲基(甲川基)共轭链并被两个含氮杂环封端构成的一类共轭有机小分子体系。随着科学研究的不断深入，花菁染料的种类也越来越丰富。

其中，近红外甲川花菁染料的吸收和发射光谱位于近红外区域(>650nm)，可以大大降低生物基体的背景干扰，由于散射光强与波长的四次方成反比，拉曼散射随波长增加迅速降低，使散射干扰也大为减少。七甲川花菁染料的吸收波长更长，背景干扰更小，组织穿透深度更深，损伤小，更适用于生物样品的检测，应用前景也十分广阔。

值得注意的是，基于七甲川花菁染料合成的半花菁结构染料在作为荧光探针时，在近红外波长区域有较强的吸收和发射，光热性质和化学稳定性都有提高，而且可以降低背景荧光干扰，提高组织穿透深度，可应用于近红外荧光成像领域；染料分子带有电荷，在合成过程中通过调节两亲性及共轭结构，可以实现对亚细胞结构的靶向。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中的不足，设计并合成一种半花菁结构的近红外荧光探针，该探针具有近红外吸收和发射性能、良好的光化学稳定性，可以高度靶向内质网，探针适度的电荷、两亲性及共轭结构对内质网膜具有特异性靶向作用，可实现对细胞内质网的高度靶向成像。

本发明的技术方案为：本发明提供了一种近红外荧光探针，其结构通式为：

其中R为碳原子数在5-8之间的直链或支链烃基，X为卤素原子F、Cl、Br中的一种。

所述近红外荧光探针的制备方法，具体包含以下步骤：

(1)化合物1的制备

将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与卤化烃(其中烃基是碳原子数在5-8之间的直链或支链烃基，卤素为F、Cl、Br中的一种)在甲苯中于105-120℃的温度条件下进行反应，反应结束后进行冷却，将冷却后的反应体系倒入石油醚中进行沉降，抽滤并用丙酮进行洗涤，得到的白色粉末即为化合物1。

(2)化合物2的制备

将DMF和二氯甲烷的混合体系冷却至0℃，向混合体系中加入三氯氧磷和二氯甲烷的混合溶液，接着将环己酮缓慢加入到混合体系中，搅拌0.5-1h，升温至40-60℃回流直至反应结束；

将上述反应完全的混合体系冷却至室温并滴入冰水中淬灭三氯氧磷，连续搅拌，回收水相，低温保存12h，抽滤并用冷水洗涤得到黄色固体即化合物2。

(3)化合物3的制备

在氮气保护条件下，将所述化合物1、化合物2和乙酸钾加入乙酸酐溶液中，于50-70℃条件下进行避光反应，反应完全后静置析出固体，抽滤，石油醚洗涤得到绿色固体即化合物3。

(4)近红外荧光探针mCy7的制备

以DMF为溶剂，在化合物3和间苯二酚的混合体系中加入三乙胺，在氮气的保护作用下于90-120℃的反应条件下进行避光反应，待体系冷却至室温后减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到蓝色固体物质即mCy7。

进一步地，所述近红外荧光探针的制备方法的步骤1中的反应温度为110-115℃。

进一步地，所述近红外荧光探针的制备方法的步骤4中的反应温度为108-113℃。

进一步地，所述近红外荧光探针可应用在内质网膜的特异性靶向中。

进一步地，所述近红外荧光探针可应用在荧光成像、时间分辨成像中。

进一步地，所述近红外荧光探针可应用在活细胞或活体的生物标记中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明所述的近红外荧光探针的制备及分离提纯过程相对简单、产率较高，制备的探针不仅有较好的水溶性和生物相容性，其光化学稳定性也很高；

2.本发明所述的近红外荧光探针的吸收和发射波长位于近红外光区，用于细胞成像时，降低了背景荧光的干扰，组织穿透深度提高；

3.本发明所述的近红外荧光探针可以高度靶向内质网，探针适度的电荷、两亲性及共轭结构可以实现对以脂质为主体、外负内正的内质网膜的特异性靶向，实现对细胞内质网的高度靶向成像；

4.本发明所述的近红外荧光探针可用于荧光成像、时间分辨成像及活细胞或活体的生物标记。

附图说明

图1为本发明一种近红外荧光探针的核磁共振谱图；

图2为本发明一种近红外荧光探针的MOLDI-TOF-MS谱图；

图3为本发明实施例2中近红外荧光探针的紫外吸收谱图；

图4为本发明实施例2中近红外荧光探针的荧光发射谱图；

图5为本发明实施例3中近红外荧光探针与商业内质网染料在细胞内共孵育后的共聚焦成像图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

实施例1：探针合成

(1)化合物1的制备：

2,3,3-三甲基吲哚(10.0mmol,1.0eq.)与溴己烷(40.0mmol,4eq.)在甲苯(25mL)中反应，反应结束后进行冷却，接着倒入200mL石油醚中沉降，抽滤并用丙酮洗涤得到白色粉末1。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.64-7.61(m,1H),7.59-7.56(m,3H),4.68(t,J＝7.6Hz,2H),3.12(s,3H),1.67(d,J＝6.8Hz,9H),0.872(t,J＝7.2Hz,3H).

(2)化合物2的制备：

将DMF(68mmol,5.4eq.)和二氯甲烷(5.0mL)的混合体系冷却至0℃再加入三氯氧磷(23mmol,2.3eq.)和二氯甲烷(5.0mL)的混合溶液，之后将环己酮(12.5mmol,1.0eq.)缓慢加至混合体系中搅拌0.5小时后升温至50℃回流至反应结束，将体系冷却至室温并滴入100mL冰水中淬灭三氯氧磷，持续搅拌半个小时后收集水相，低温保存12小时后抽滤并用冷水洗涤得到黄色固体2。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.46(t,J＝6.2Hz,4H),1.75-1.68(m,2H).

(3)化合物3的制备：

在氮气保护下，将所述化合物1(2.5mmol,1eq.)、新制备的化合物2(1.25mmol,0.5eq.)、乙酸钾(5.0mmol,2.0eq.)在乙酸酐中于70℃条件下进行避光反应至原料反应完全，静置析出固体，抽滤并用石油醚洗涤得到带有金属光泽的绿色固体3。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.26(s,1H),8.22(s,1H),7.63(s,1H),7.63(s,1H),7.61(s,1H),1.87-1.81(m,2H),7.45-7.40(m,4H),7.29-7.25(m,2H),6.32(s,1H),6.29(s,1H),4.20(t,J＝7.2Hz,4H),2.69(t,J＝6.0Hz,4H),1.87-1.81(m,2H),1.75-1.69(m,4H),1.65(s,10H),1.40-1.21(m,14H),0.83(t,J＝8.0Hz,6H).

(4)探针mCy7的制备：

以DMF(10.0mL)为溶剂，在化合物3(0.5mmol,1.0eq)与间苯二酚(5.0mmol,10.0eq)的混合溶液中加入三乙胺(5.0mmol,10.0eq)后，在氮气保护条件下于110℃下进行避光反应，反应结束后，将体系冷却至室温并减压蒸馏除去溶剂，柱层析提纯得到蓝色固体mCy7。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.14(d,J＝11.6Hz,1H),7.33(s,1H),7.30(t,J＝7.2Hz,2H),7.22(d,J＝9.2Hz,1H),7.08(t,J＝9.2Hz,1H),6.85(d,J＝7.6Hz,1H),6.82(dd,J＝2.0Hz,9.2Hz,1H),6.67(s,1H),5.67(d,J＝13.6Hz,1H),3.80(t,J＝7.2Hz,2H),2.68(t,J＝6.4Hz,2H),2.60(t,J＝6.4Hz,2H),1.935-1.873(m,2H)，1.796-1.722(m,2H)1.68(s,6H),1.45-1.26(m,6H),0.90(t,J＝4.0Hz,3H).

实施例2：所述近红外荧光探针的光物理性质测试

配置浓度为10^-3mol/L的实施例1中制得的近红外荧光探针的DMSO溶液，在测试实验中取该母液30μL稀释到石英比色皿中的3mL DMSO中，放于紫外吸收光谱仪中进行测试，测得所述近红外荧光探针在DMSO中的最大吸收峰位于680nm处。再将此溶液放于荧光光谱仪中进行测试，测得所述近红外荧光探针在DMSO中的最大发射波长位于745nm处。

紫外吸收与荧光发射测试表明所述近红外荧光探针的吸收和发射波长位于近红外区域。

实施例3：所述近红外荧光探针在细胞内质网靶向成像中的应用

根据常规方法培养HeLa细胞；

配置浓度为10^-3mol/L的实施例1中制得的近红外荧光探针的DMSO溶液，在细胞成像实验中取该母液10μL稀释到1mL胎牛血清中；

将2μL商业内质网染料ER Tracker-Red稀释到2mL胎牛血清中；

将培养好的HeLa细胞用PBS缓冲溶液洗三次，然后用上述配好的所述近红外荧光探针的胎牛血清溶液培养15分钟后，加入上述稀释过的商业内质网染料溶液继续培养15分钟。

明场成像和荧光成像用共聚焦显微镜观测。共聚焦显微镜激发波长为559nm时，收集波段通道为600-630nm，激发波长为630nm时，收集波段通道为650-720nm。

图5为本发明所述近红外荧光探针和商业内质网染料在细胞培养后的两组共聚焦成像图。图中可以看出，所述近红外荧光探针与商业内质网染料在细胞中的成像位置几乎完全重合，共聚焦成像系统得到的两组共定位系数分别为91.76％和93.77％。

细胞成像实验结果表明，所述近红外荧光探针对细胞内质网具有高度的靶向性。