本发明涉及一种红花素的分离纯化方法，尤其涉及一种木棉花红色素的分离纯化方法。
背景技术
木棉花具有很高的药用价值。在中国，木棉花既是传统中药，也是凉茶的重要原材料，民间采摘或拾取盛开花朵晒干，用于清热利湿、活血消肿，在中医治疗中常被用作治疗慢性胃炎、肠炎、痔疮出血和细菌性痢疾等疾病。据研究表明，木棉树的抗逆物质和营养物质主要储存库是花瓣，其中花瓣基部和花萼顶部物质含量和种类相对较高，花瓣中的sod活性强，具有抗氧化等活性。近年也有关于采用木棉花花朵提取色素的报道。但是目前对木棉花色素提取的主要方法是利用酸化乙醇的方法，缺陷是提取率不是很高，木棉花中的主要成分从木棉花中得到了的化学成分有花青素、黄酮、倍半萜类、酚类、类固醇、糖类及氨基酸等，黄酮会干扰红色素提取。
植物花瓣的颜色主要是由于类黄酮物质引起的它可分为类胡萝卜素和花青素，而类黄酮物质中的类胡萝卜素对光，酸，温度较为敏感，花青素在植物中常以糖苷的形式存在，从而形成较为稳定的花色苷。花色苷色素在水溶液中主要以蓝色的醌式碱，红色的花钅羊盐(钅羊盐指的是是羟基上的氧再提供一对孤对电子给一个游离的h+，形成—oh2+基团)，离子(ah+)，无色的假碱，查尔酮四种结构存在，且随着ph的变化在四种结构之间存在着平衡。
技术实现要素：
本发明的目的在于对木棉花红色素提取和纯化方法进行优化，筛选出效果较好的分离纯化方法，为开发应用提供理论依据，以解决现有技术存在的问题。
为解决上述问题，本发明提供了一种木棉花红色素的分离纯化方法，
(1)材料前处理：先将红色木棉花清洗烘干粉碎；
(2)将粉碎后的红色木棉花按照质量：体积为1：50的投料比，采用0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝3:1作为提取剂，在70℃下浸提100min；
(3)将步骤(2)所得提取液浓缩去除乙醇和盐酸混合溶液，得到粗提的木棉花色素原液；
(4)通过预实验选择大孔树脂并进行预处理；
(5)树脂柱层析对提取液的吸附纯化：将步骤(3)粗提的木棉花色素原液以1-3bv/hr的流速通过步骤(4)预处理后的大孔树脂；
(6)解吸样品：用1-2bv蒸馏水量换出树脂层的原液，等检出液中流出不再有木棉花原液残液，流出液变透明；用75％乙醇以1-2bv/hr的速度通过树脂层，以洗脱目的产物，收集洗脱液；
(7)将步骤(6)得到的洗脱液通过旋转蒸发仪蒸掉部分水和全部酒精，再-20℃冰箱预冻，真空冷冻干燥24小时，得到红色的木棉花色素粉末。
本发明的提取温度为70℃，而且采取的方法是真空冷冻干燥，因为花色苷不耐高温，本发明能更好防止色素降解。本发明用0.1mol/l盐酸酸化保持低的ph，阻止无酰基花色苷降解；又因为盐酸浓度为0.1mol/l，且从加入盐酸到除去盐酸并没有浓缩，盐酸浓度低于0.12mol/l，含酰基部分的花色苷也没有水解，使提取的色素更接近天然状态。盐酸的酸性较强，更好破坏植物细胞膜及溶解植物细胞膜，选择乙醇作为溶剂。本发明综合考虑了溶剂毒性即安全性、保持色素的原始状态及产量。
旋转蒸发仪蒸掉部分水和全部酒精主要是去掉全部酒精，因为酒精和水的混合液无法在-20℃结冰，蒸发掉部分水减少过多真空干燥步骤过程，留取部分水是为了防止蒸馏到水分都干了时，木棉花色素粉末全部粘在圆底瓶里面难以取出，造成很大损失，留下部分水分可以通过真空干燥的方式升华掉。
进一步的，所述大孔树脂为d4020大孔树脂。通过木棉花红色素柱层析分离，木棉花红色素通过d4020、d101大孔树脂吸附柱层析分离后，均出现了一个洗脱峰，但是d4020树脂吸附柱层析的洗脱峰较窄，洗脱下来的红色素相对集中，即分离洗脱的效果比较好。
进一步的，步骤(4)所述对大孔树脂预处理主要包括以下步骤：将15gd4020大孔树脂以95％乙醇浸泡24h后装柱，用蒸馏水以1-2bv/hr的速度淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊或无明显乙醇气味时为止树脂表面上保持2-5mm液体，以免干柱，备用。
进一步的，步骤(1)所述对木棉花烘干粉碎为：先用烘箱在60℃将木棉花烘干处理24-30h；剪碎成较小的块状，再用小型粉碎机粉碎，过60目网筛。
与现有技术相比，本发明通过比较盐酸溶液：70％乙醇不同比例的提取率，对效果较好方法的各提取因素进行正交实验优化。再经d4020大孔树脂柱层析纯化提取液，吸附木棉花色素进行纯化。能快速高效地提取木棉花红色素，纯度较高，操作简便。而采用安全无毒的提取剂保证了木棉花色素应用于食品加工的可靠性，为食品的安全提供科学性的支撑。可作为着色剂广泛应用于各类食品添加剂中。
附图说明
图1是本发明木棉花红色素的分离纯化的流程图；
图2是花色苷的四种结构转化示意图；
图3是实施例2中0.1mol/l盐酸：70％乙醇不同配比对木棉花红色素提取效果的影响对比图，其中组号1到5分别是1:3、1:2、1:1、2:1、3:1；
图4是实施例3中料液比对木棉花色素提取效果的影响对比图，其中组号1到5分别是1:20、1:40、1:60、1:80、1:100；
图5是实施例4中时间对木棉花红色素提取效果的影响对比图，其中组号1到4分别是30min，60min，90min，120min；
图6是实施例5中提取温度对木棉花红色素提取效果的影响对比图；其中组号1到5分别是40℃，50℃，60℃，70℃，80℃；
图7是实施例6中木棉花色素提取正交实验探索最佳实验条件探索对比图；
图8是实施例1得到的红色的木棉花色素粉末。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种木棉花红色素的分离纯化方法，如图1所示，主要包括以下步骤：
(1)材料前处理：先用烘箱设置60℃将洗干净的木棉花烘干，约24-30小时，剪碎成较小的块状，再用小型粉碎机粉碎，过60目网筛，保存于干燥瓶内。
(2)将粉碎后的红色木棉花按照1：50(质量：体积)的投料比，采用0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝3:1作为提取剂，在70℃下浸提100min。
(3)将步骤(2)所得提取液浓缩去除乙醇和盐酸混合溶液，得到粗提的木棉花色素原液。
(4)大孔树脂预处理。新d4020大孔树脂(约15g)以95％乙醇浸泡24h后装柱(注入3/4预计树脂高度的蒸馏水，将树脂用蒸馏水调匀，均匀倒入，同时旋开活塞，使水慢慢流出，添加完树脂最好在树脂上层盖层滤纸)，用蒸馏水以1-2bv/hr的速度淋洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊或无明显乙醇气味时为止(同时也让蒸馏水把树脂压紧)，树脂表面上保持2-5mm液体，以免干柱，备用。
(5)树脂柱层析对提取液的吸附纯化，将步骤(3)粗提的木棉花色素原液以1-3bv/hr的流速通过步骤(4)预处理后的大孔树脂，树脂层中不能有气泡，加入木棉花原液约25ml。
(6)解吸样品：用1-2bv蒸馏水量换出树脂层的原液，等检出液中流出不再有木棉花原液残液(红色)，流出液变透明。用75％乙醇以1-2bv/hr的速度通过树脂层，以洗脱目的产物，收集洗脱液，即为浓缩了的木棉花纯化色素液。
(7)通过旋转蒸发仪蒸掉一部分水和全部酒精，再-20℃冰箱预冻，真空冷冻干燥24小时，得到红色的木棉花色素粉末，如图8，木棉花固体红色素，呈晶体或粉末，符合感官要求，提取率可达50mg·g-1。
实施例2
提取剂选择
先将红色木棉花清洗烘干粉碎后，分别在盐酸、乙醇、盐酸和乙醇的混合液三者中浸泡一定时间，发现在盐酸和乙醇的混合液提取木棉花色素更好。
以0.1mol/l盐酸溶液和70％乙醇混合液作为提取剂。0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝1:3、1:2、1:1、2:1、3:1，取大约0.1g克木棉花花瓣粉末，加入10ml提取剂，在40℃浸提2h后，3000r/min离心三分钟，得提取液。以各自空白提取剂作为参比液，测定各提取液在520nm时吸光度值。考察提取剂配比对木棉花色素提取的影响。由图2可知，花色苷色素在水溶液中主要以蓝色的醌式碱(a)，红色的花钅羊盐离子(ah+)，无色的假碱(b)，查尔酮(c)四种结构存在，且随着ph的变化在四种结构之间存在着平衡。随着ph的升高，花色苷色素损失加快质子形成蓝色的醌式碱(a)。理论上而言，ph的增大会使得提取的效果也来越差，但是从图3及表1结果所示，可认为乙醇的浓度对于提取的效果也有一定的影响，从而使得提取剂配比(0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇)中，2:1，3:1的提取效果有所提高。在所选取的提取剂配比(0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇)中，1:3、2:1、3:1的吸光度较高，颜色为比较亮的红色。可选取这三组实验条件进行进一步的正交试验，优化提取条件。
表1提取剂配比对木棉花色素提取的影响
实施例3
料液比的选择
各取约0.15g木棉花花瓣粉末，加入3，6，9，12，15ml0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝1:1的提取剂中(料液比＝1:20，1:40，1:60，1:80，1:100)，制成匀浆，在60℃下浸提1h，3000r/min离心4min，取上层提取液。以各自空白提取剂作为参比液，直接测定各提取液在520nm时吸光度值。做三组平行实验。考察料液比对木棉花红色素提取的影响。当其他条件不变时，料液比过高，溶液的增加对其浓度有着稀释的作用，从而导致吸光度的降低。此时相应地减少料液比也可达到同样的提取效果，不必造成提取液的浪费。而当料液比过低时，所添加的提取剂由于含量过低，无法完全将木棉花色素提取出来，也是不可采取的提取条件。
结果由表2和图4可知，料液比1:60时，提取的木棉花红色素的吸光度达到最大值，此时木棉花红色素提取效果较好，因而可选用料液比为1：50，1:60,1:70进行正交试验，进一步地优化实验条件。
表2料液比对木棉花色素提取效果的影响结果
实施例4
提取时间的选择
各取0.1g木棉花花瓣粉末，加入10ml0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝1:1的提取剂，分别在60℃下浸提30min，60min，90min，120min，150min。3000r/min离心三分钟，得提取液。以各自空白提取剂作为参比液，测定各提取液在520nm时吸光度值。做三组平行实验。结果如表3和图5可知，
在30min-90min期间，随着时间增加，提取的木棉花色素含量增加从而使得吸光度逐步提高。在90-120min期间，随着时间增加，吸光度降低，原因可能在木棉花色素的提取量达到最大值时，花色苷色素在60℃的温度下，溶液的四种存在方式中，平衡朝着无色的查尔酮方向进行，从而导致了吸光度的下降。而在120-150min期间，吸光度增大，原因可能是由于花色苷色素可以与自身的其他物质如黄酮或多糖类物质发生缩合反应，形成的产物使颜色加深而红移。综上，提取时间为90min左右，对木棉花色素提取效果较好，因而选取提取时间为80min，90min，100min进行正交试验。
表3提取时间对木棉花色素提取效果的影响
实施例5
提取温度的选择
各取0.1g木棉花花瓣粉末，加入10ml0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝1:1的提取剂，分别在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃浸提2h，3000r/min离心三分钟，得提取液。以各自空白提取剂作为参比液，测定各提取液在520nm时吸光度值。做三组平行实验。
结果如表4和图6所示，一定程度的温度升高有利于红棉花红色素在提取液中的溶解，因而在40-70℃区间，随着温度上升，吸光值增加。而在70-80℃之间，吸光值逐渐下降，原因可能是在花色苷色素溶解达到一定程度时，随着温度的增加，溶液的平衡朝着无色的查可酮方向进行造成的。因此，在提取温度为70℃左右，对木棉花色素提取效果最好。
表4提取温度对木棉花色素提取的影响结果
实施例6
正交优化实验
根据单因素实验得到的结论设置正交表如表5，按照条件处理木棉花(花瓣粉末和提取剂制成匀浆)(木棉花花瓣粉末0.15g左右，料液比1：50、1:60、1:70)，浸提完毕，3000r/min离心4分钟，得提取液。以各自空白提取剂作为参比液，测定各提取液在520nm时吸光度值。做三组平行实验。结果如表5和图7，可知木棉花红色素提取的最适宜条件是：0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝3:1采用作为提取剂，按1：50(质量：体积)的投料比，在70℃下浸提100min，木棉花红色素有较大的提取率。
表5木棉花提取色素正交表
注：提取剂*：提取剂配比＝0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇
从木棉花含有红色素，木棉花红色素提取最佳工艺：采用0.1mol/l盐酸溶液：70％乙醇＝3:1作为提取剂，按1：50(质量：体积)的投料比，在70℃下浸提100min时，木棉花有较大的提取率，提取率可达50mg·g-1。用d4020大孔树脂吸附木棉花红色素，经解脱，旋转蒸发浓缩，真空干燥(24h)得到木棉花固体红色素，呈晶体或粉末，符合感官要求。