基于亲和组装的高发光量子点荧光微球的制备方法与流程
本发明涉及一种基于油溶性量子点以及二氧化硅亲和模板的复合荧光微球的制备方法，该方法制得的荧光微球粒径均一、尺寸可控、发光强度高并且性能稳定。
(二)
背景技术：
量子点具备高发光强度、波长可调谐性、抗光漂白以及一元激发多元发射等特性，近年来成为生物医学领域普遍关注的热点。具有高发光性能以及单分散性(色纯度高)的量子点一般通过高温热分解法合成。该类量子点表面被一层有机配体分子所包裹，在其应用于生物体系之前，水溶性修饰是不可避免的。现有的油溶性量子点的水溶性修饰策略主要包括配体替换、两亲性分子包裹以及二氧化硅修饰等等。其中配体替换是开发最早的修饰方法，简单易行，但量子点的荧光性能损失严重，且胶体及光化学稳定性都比较差；采用两亲性分子修饰可以保留量子点的疏水配体，进而保持其发光性能及稳定性，但聚合物的合成费用高昂、过程复杂，量子点产物难于分离纯化。
将量子点与纳米载体进行组装不仅可有效改善量子点的生物相容性，还可将单一量子点的荧光信号进行有效放大，并能通过统计效应来抑制单一量子点的闪烁现象。利用纳米、微米尺度的量子点荧光微球建立起来的分析方法：例如基于荧光编码技术的多元分析、细胞内多目标的同时可视化检测、超灵敏荧光标记检测及荧光成像等，为生物光学传感研究带来了新的机遇。向荧光微球中引入其他功能材料例如贵金属、磁性纳米粒子等，可构建用于医学多模态成像及诊断-治疗一体化研究的功能复合材料。
现有技术的主要缺点：以聚苯乙烯微球为模板的技术方案，主要将微球溶胀后通过疏水相互作用来负载量子点，导致量子点容易发生泄漏，且聚苯乙烯存在亲水性差以及光学透明度低等缺陷；以二氧化硅微球为模板的技术方案，主要利用共价偶联或静电吸附的方式将量子点组装于载体表面，例如以碳二亚胺活化水溶性量子点的羧基后，与氨基改性的二氧化硅微球形成酰胺键；或在特定ph值下，将羧基化量子点与氨基化二氧化硅微球静电吸附合成荧光微球。在以上技术中，需要对油溶性量子点进行相转移以及羧基化修饰，可能导致量子点团聚或荧光猝灭；同时，在水相体系中实现组装，将受量子点之间静电排斥作用影响，导致组装效率低。
决定量子点荧光微球最终亮度的因素主要有两个：一、量子点固有的发光强度(量子产率)；二、量子点在纳米载体上的组装效率。一般来讲，通过有机相高温热分解法制备的量子点具备高发光、荧光光谱窄以及稳定性优良等特性，这些性质对于光学传感应用都极为重要。另一方面，利用配体与金属之间的亲和作用(配位作用)将疏水纳米粒子直接固定到载体表面是一种高效的组装方法。可以避免水相组装中由静电排斥导致的颗粒包覆密度低，以及共价偶联过程对量子点表面的破坏等问题。
二氧化硅具有较高的光学透明度、易于合成及尺寸控制，并可以进行多种表面硅烷化改性，因此是一种优良的纳米载体。将带有金属亲和性表面(如硫醇修饰)的二氧化硅载体与油溶性量子点在有机相中直接组装具备几大优势：组装效率高、避免了繁琐的量子点相转移等前处理并且有利于量子产率的保持。在获得了高发光以及高负载的二氧化硅/量子点微球之后，需对疏水组装体进行水溶性修饰，才能满足生物应用需求。在微球表面包覆另一层二氧化硅能有效改善其水溶性及稳定性并有利于生物功能化，同时保留量子点表面的疏水配体是二氧化硅修饰过程中决定其发光性能的关键。对于量子点组装体而言，仍需探索保持量子点发光效率的有效硅烷化方法，以保证荧光微球的性能。
(三)
技术实现要素：
本发明公开了一种水溶性、高发光量子点荧光微球的制备方法，本发明制备的量子点荧光微球颗粒单分散性好、尺寸可控、量子点负载量高且具有较高量子产率，可用于纳米诊断分析与成像探针。本发明方法首先在有机相中利用金属-配基亲和作用制备了高负载的二氧化硅/量子点组装体；以正辛基三甲氧基硅烷/甲醇/氨水为水解体系，实现了该疏水组装体的硅烷化修饰，并确保修饰过程中二氧化硅载体对量子点的高负载量。通过有机硅烷水解缩合、
本发明的技术方案如下：
一种量子点荧光微球的制备方法，所述方法为：
(1)二氧化硅模板的合成
将乙醇、水、氨水(25～28wt％)按体积比1：0.06～0.08：0.04～0.05混合，得到乙醇、水、氨水的混合液a，搅拌下升温至50℃，加入乙醇和正硅酸乙酯体积比1：0.3～0.4的混合溶液a，保温搅拌5h，得到体系a，接着将体系a加到乙醇、水、氨水体积比1：0.15～0.2：0.1～0.2的混合液b中于50℃下搅拌，滴加乙醇和正硅酸乙酯体积比1：0.1～0.2的混合溶液b，保温搅拌5h，之后离心，收集沉淀物，洗涤，得到二氧化硅微球；
所述乙醇、水、氨水的混合液a与乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液a的体积比为1：0.1～0.2；
所述体系a与乙醇、水、氨水的混合液b以及乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液b的体积比为1：9～10：1～2；
所述“乙醇、水、氨水的混合液a”、“乙醇、水、氨水的混合液b”，没有特殊的含义，标记为“a”、“b”只是用于不同操作步骤中相同物料的区分，“乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液a”、“乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液b”、“体系a”同理；
(2)二氧化硅模板的巯基化修饰
将步骤(1)所得二氧化硅微球分散到乙醇中，加入巯丙基三甲氧基硅烷(mps)、氨水，室温搅拌12h，离心、洗涤，得到巯基化二氧化硅微球，分散至乙醇中于4℃保存；
所述乙醇的体积用量以二氧化硅微球的质量计为80～120ml/g；
所述巯丙基三甲氧基硅烷的体积用量以二氧化硅微球的质量计为1～3ml/g；
所述氨水的体积用量以二氧化硅微球的质量计为2～3ml/g；
(3)量子点与二氧化硅微球的组装
将步骤(2)所得巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清液，加入油溶性量子点溶液，超声混匀，离心，收集沉淀物，洗涤，得到二氧化硅/量子点复合物；
所述油溶性量子点为cdse/zns，量子点表面配体为除了烷基硫醇(如1-十二硫醇)以外的其他常用配体(如脂肪酸、脂肪胺、三辛基氧磷等)，所述油溶性量子点溶液中的溶剂为常用非极性溶剂，包括甲苯、氯仿、环己烷、正己烷等；
所述油溶性量子点溶液的浓度为8～12mg/ml；
所述油溶性量子点溶液的体积用量以巯基化二氧化硅微球的质量计为80～120ml/g；
(4)量子点组装体的硅烷化及二氧化硅修饰
将步骤(3)所得二氧化硅/量子点复合物在空气中干燥，加入正辛基三甲氧基硅烷(otms)，超声溶解，然后加入甲醇和氨水体积比1：0.02～0.03的混合液，超声混匀，离心，收集沉淀物并分散在水中，加入氨水，室温搅拌12h，得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球溶液，再将所得硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球溶液加入乙醇和氨水体积比1：0.03～0.04的混合液中，分批加入正硅酸乙酯搅拌反应6h，之后离心，收集沉淀物，洗涤，得到所述量子点荧光微球；
所述正辛基三甲氧基硅烷的体积用量以二氧化硅/量子点复合物的质量计为2.5～2.7ml/g；
所述甲醇和氨水的混合液的体积用量以二氧化硅/量子点复合物的质量计为190～210ml/g；
所述水的体积用量以二氧化硅/量子点复合物的质量计为400～500ml/g；
所述氨水的体积用量以二氧化硅/量子点复合物的质量计为0.6～0.7ml/g；
所述硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球溶液与乙醇和氨水的混合液、正硅酸乙酯的体积比为1：4～4.5：0.01～0.03。
本发明的有益效果在于：
1、在有机相中对量子点直接组装，无需对量子点进行任何表面改性及修饰。
2、利用巯基-金属亲和作用，实现量子点在二氧化硅表面的高密度负载。
3、借助烷基硅烷试剂对量子点表面的包覆(疏水相互作用)，实现量子点微球的相转移，有效避免了常规配体替换方法造成的量子点发光效率下降。
4、经过有机硅烷水解缩合以及
(四)附图说明
图1：量子点复合微球的制备过程示意图；
图2：200nm二氧化硅微球(a)、二氧化硅/量子点微球(以200nm硅球为模板，b)、二氧化硅/量子点/二氧化硅复合微球(以200nm硅球为模板，c)以及二氧化硅/量子点微球(以90nm硅球为模板，d)的透射电镜图；
图3：量子点及复合微球的荧光光谱(1量子点，2以200nm硅球为模板制得的复合微球，3以90nm硅球为模板制得的复合微球)。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取10ml上述溶液加入70ml乙醇、13ml水及7.5ml氨水中搅拌。将1mlteos及10ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h可得到90nm的二氧化硅球；将上述种子生长过程再重复3次，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备200nm的二氧化硅球。
(2)将0.5g纯化后的二氧化硅微球分散至50ml乙醇中，加入500μlmps及1.25ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为20mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液2ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入60μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入4.5ml甲醇及112μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于10ml水中并加入15μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
实施例2：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取20ml上述溶液加入140ml乙醇、26ml水及15ml氨水中搅拌。将2mlteos及20ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h可得到90nm的二氧化硅球；将上述种子生长过程再重复3次，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备200nm的二氧化硅球。
(2)将1.0g纯化后的二氧化硅微球分散至100ml乙醇中，加入1mlmps及2.5ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为40mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液4ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入120μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入9.0ml甲醇及224μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于20ml水中并加入30μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
实施例3：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取50ml上述溶液加入350ml乙醇、65ml水及37.5ml氨水中搅拌。将5mlteos及50ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h可得到90nm的二氧化硅球；将上述种子生长过程再重复3次，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备200nm的二氧化硅球。
(2)将2.5g纯化后的二氧化硅微球分散至250ml乙醇中，加入2.5mlmps及6.25ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为100mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液10ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入300μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入22.5ml甲醇及560μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于50ml水中并加入75μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
实施例4：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取10ml上述溶液加入70ml乙醇、13ml水及7.5ml氨水中搅拌。将1mlteos及10ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备90nm的二氧化硅球。
(2)将0.5g纯化后的二氧化硅微球分散至50ml乙醇中，加入500μlmps及1.25ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为20mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液2ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入60μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入4.5ml甲醇及112μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于10ml水中并加入15μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
实施例5：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取20ml上述溶液加入140ml乙醇、26ml水及15ml氨水中搅拌。将2mlteos及20ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备90nm的二氧化硅球。
(2)将1.0g纯化后的二氧化硅微球分散至100ml乙醇中，加入1mlmps及2.5ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为40mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液4ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入120μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入9ml甲醇及224μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于20ml水中并加入30μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
实施例6：
(1)将80ml乙醇，4.85ml水以及3.6ml氨水混合搅拌并逐渐加热到50℃。将8ml乙醇及3.1mlteos的混合溶液快速加入反应瓶，在50℃搅拌5h。取50ml上述溶液加入350ml乙醇、65ml水及37.5ml氨水中搅拌。将5mlteos及50ml乙醇的混合溶液滴加至反应瓶中并搅拌5h，将所得溶液用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次，以制备90nm的二氧化硅球。
(2)将2.5g纯化后的二氧化硅微球分散至250ml乙醇中，加入2.5mlmps及6.25ml氨水，室温搅拌12h。用10000rpm离心并用乙醇洗涤3次可得到巯基化的二氧化硅微球。将产品分散至乙醇中4℃保存。
(3)将巯基化二氧化硅微球的乙醇溶液离心，弃去上清(沉淀干重为100mg)。加入cdse/zns量子点的甲苯溶液10ml(10mg/ml)，并超声5min得到均相透明溶液。以10000rpm离心5min将二氧化硅/量子点复合物沉淀。将二氧化硅/量子点沉淀用甲苯洗涤1～2次以除去游离的cdse/zns量子点。
(4)将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中适当干燥后加入300μl正辛基三甲氧基硅烷，在超声条件下将沉淀溶解得到均相溶液。向硅烷溶液中加入22.5ml甲醇及560μl氨水并超声30min。用10000rpm将二氧化硅/量子点离心并用甲醇洗去过量的硅烷试剂。将上述沉淀分散于50ml水中并加入75μl氨水，在室温下搅拌至少12h得到硅烷化的二氧化硅/量子点荧光微球。可通过
对比例：
现有技术：聚苯乙烯微球包埋法制备量子点荧光微球(参考文献：nancyjoumaa,muriellansalot,alaintheretz,andabdelhamidelaissari.synthesisofquantumdot-taggedsubmicrometerpolystyreneparticlesbyminiemulsionpolymerization.langmuir2006,22,1810-1816.)
制备过程：首先将苯乙烯与正十六烷和cdse/zns量子点混合，然后在剧烈搅拌下将该有机相加入到水相(水，十二烷基硫酸钠和碳酸氢钠)中。反应10分钟后，将所得混合物超声7分钟，然后将得到的微乳液通45min氮气除氧，同时将温度升至75℃。最后，加入过硫酸钾水溶液在氮气环境中反应5小时。
通过该方法制备的荧光微球的量子点负载率较低，分布不均匀，荧光强度不高，从而限制了该量子点荧光微球在生物领域的应用。相比之下，本发明制得的荧光微球具有高效均匀负载、尺寸均一、发光强度高、性能稳定等优点，可应用于医学多模态成像体外诊断以及多元生物分析。
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