一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及人羧酸酯酶亚型2 (hES2)的特异性荧光探针 及其应用。
【背景技术】
[0002] 羧酸醋酶（Carboxylesterase，CES)是机体内重要的I相水解代谢酶，催化多种 内源性和外源性化合物发生酯键断裂，释放出极性的醇和羧酸分子片段，后者进而被体内 CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中 含有酯键的药物分子，如盐酸伊立替康（11^11 〇仏(^11，0?1'-11)、奥司他韦（达菲）、氯吡格雷 等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。
[0003] 人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族：hCEl和hCE2,其中hCEl又 可继续被分为hCElb和hCElc两种亚型。hCEl和hCE2具有不同的组织分布特异性及底物 选择性，人的肝脏中主要分布表达hCEl，同时表达一定量的hCE2,而小肠中则基本以hCE2 亚型为主，只有极少量的hCEl分布。近年来发现多种肿瘤细胞中hCE2的表达水平上调，可 借助此特征设计经hCE2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目 的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道中hCE2酶对酯 类药物的代谢被认为是其首次代谢的重要组成部分，hCE2酶活性的差异对于前体药物的生 物利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经 过胆汁排泄被分泌到肠道中，继而被肠道中的hCE2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38， 后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而，建立基于探针的高通量 技术手段，对于筛选hCE2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以 及对hCE2功能的定量检测都十分重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶hCE2的特异性荧光探针及其应用，该底 物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种 生物体系中hCE2的分布和功能进行定量评价。
[0005] 本发明提供了一种人羧酸酯酶亚型2 (hCE2)的特异性荧光探针底物，该底物的酯 键在人源组织或细胞中可被hCE2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波 谱；该底物是以4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应获得相应7-羟 基酯类衍生物，其结构通式如式（1)所示，其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基 苯基、对己基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、 4-乙氧基苯基取代基中的一种。
[0006]
【主权项】
1. 一种人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针，其特征在于：该探针的底物的醋键可被 hCE2特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的巧光； 该底物为4-S氣甲基-7-哲基香豆素醋类衍生物，其结构通式如式（1)所示，其中， R为苯基、对甲基苯基、对己基苯基、对丙基苯基、对己基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈 基、2-快喃基、2-唾吩基、（4-苯基）苯基、4-己氧基苯基取代基中的一种。
2. -种权利要求1所述人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针的应用，其特征在于：该 探针底物作为hCE2的特异性底物，可利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解 产物的生成量来测定不同酶源中hCE2的活性。
3. 根据权利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针的应用，其特征在于：所 述酶源为重组表达的hCE2单酶、人或动物组织制备液或各类组织细胞生物样品。
4. 根据权利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针的应用，其特征在于：所 述水解反应体系抑介于5. 5?10. 5之间；探针底物的浓度介于1/10?lOKm之间；解育体 系反应温度介于20?60°C之间，同时水解产物的转化率应介于0. 1%?20%之间。
5. 根据权利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针的应用，其特征在于：该 探针底物不具备巧光而其水解产物具有巧光属性，可采用巧光检测器实现产物及底物的快 速灵敏检测；巧光检测条件为：激发波长330?400nm，在420?660nm进行巧光发射谱的 检测。
6. 根据权利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特异性巧光探针的应用，其特征在于：该 特异性探针底物及其水解反应可用于hCE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
【专利摘要】一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物是4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物酯类衍生物，可用于检测不同生物样品中hCE2的存在与否及其活力的定量测定。酶活性具体测定流程如下：选择4-三氟甲基-7-羟基香豆素酯类衍生物水解反应为探针反应，选择适宜底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内水解代谢产物4-三氟甲基-7-羟基香豆素的生成量来测定各生物样品、细胞、载体及整体器官中hCE2酶的实际活性。本发明不仅可用于不同来源生物样本中hCE2酶活性的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选hCE2的抑制剂。
【IPC分类】C12Q1-44, C09K11-06, C07D407-12, C12Q1-04, C07D409-12, C07D311-16
【公开号】CN104592985
【申请号】CN201410836704
【发明人】崔京南, 冯磊
【申请人】大连理工常熟研究院有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月29日