专利名称：一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明公开了一种在反应釜中制备亲和层 析介质的方法。
背景技术：
目前，生物制药领域中的反应多为固液或液液反应，终产物也多为固 液混合物，在 生产过程中反应往往是在反应釜中进行反应，反应完毕后将固液混合物转移到另外一个容 器中进行后处理或通过离心进行分离。有时在反应前需要将反应物放置在一个容器中进行 预处理，反应时再将经过预处理的反应物转移到反应釜中进行反应。许多固液或液液反应 需要重复多次的预处理一反应和/或反应一后处理过程才能达到所需要的反应结果。对于 反应条件要求不剧烈，例如不需要特殊的反应温度或者要求搅拌条件温和的反应，在预处 理一反应和/或反应一后处理的转移过程中需要利用更多的容器并且增加了处理时间。例如制备亲和层析介质，一般采用的方法是首先用蒸馏水反复清洗凝胶(预处 理过程)，加入活化溶液进行反应(活化反应过程)；活化后的凝胶再次反复清洗(后处理 过程)，然后与重组蛋白A进行偶联反应(偶联反应过程)；反应后获得偶联重组蛋白A的 凝胶再次反复清洗(后处理过程)，备用。上述方法在小规模制备时，需要在多个锥形烧瓶 和布氏漏斗中反复操作，一方面增加了操作的复杂性和时间，另一方面也容易造成各种反 应成分的流失和浪费，收获的亲和层析介质仅在百克级。如果在更大规模制备时，上述方法 的费时、费力、费材料的缺陷则更明显。
发明内容
本发明公开了一种制备亲和层析介质的方法，亲和层析介质由重组蛋白A与活化 的凝胶偶联而成，其特征在于，凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反 应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行。上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，所述反应釜由釜体和釜盖组成，釜盖 位于釜体两端，在反应时，反应釜由釜体(2)、釜盖(1)和(3)组成，反应前预处理或反应后 处理反应物时，反应釜由釜体(2)、釜盖(4)和(5)组成。在该反应釜中，不但可以进行固液 或液液反应，而且还可以直接将反应前的反应物进行预处理或对反应后的终产物进行后处理。上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，包括以下几步骤a.在活化或偶联反应时，将反应物质放入反应釜中，并将反应釜的釜盖(1)、(3) 与釜体(2)固定，然后将反应釜放置到混合机上进行反应，b.在活化或偶联反应前的预处理或反应结束后进行后处理时，将反应釜的釜盖 (4)、(5)与釜体(2)固定，将釜盖(4)、(5)分别连接耐压硅胶管(6)，利用压缩空气将固液 混合物分离，c.上述a、b操作可重复进行。
上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，反应釜的釜盖(4)的中间有一通气 接头，釜盖(5)为具有不锈钢丝网(7)的不锈钢盖(8)，所述不锈钢盖(8)的中间有一通气 接头，釜盖(4)、(5)通过通气接头连接耐压硅胶管(6)。反应釜内还可以设置导流板(9)， 所述导流板(9)可以是平面板或弧型板形状。上述制备亲和层析介质的方法，其特征在于，活化反应时间为1-24小时，偶联反 应时间为3-72小时。上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，活化反应所用的活化剂是N-羟基 琥珀酰亚胺。上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，活化剂的浓度是l-10g/L。上述制备亲和层析介质的方法，，其特征在于，偶联反应 所用的重组蛋白A的浓度 是 10-60g/L。本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质的用途，用于纯化抗体蛋白。 其中公开了用于纯化抗Her2单克隆抗体的方法。本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质。本发明中反应釜的结构和工作原理介绍如下在反应时，反应釜由釜体2、釜盖1、3组成(如图1所示)。为了增加密闭效果，防 止在反应过程中反应液渗漏，釜体和釜盖接触面的中央可以有圆形凹槽，凹槽中可以放置 起密闭作用的垫圈，一般选择聚四氟乙烯垫圈，外用阀兰将釜体和釜盖固定。为了增加固液 混合效果，在釜内可以设置导流板9，导流板可为有利于固液或液液混合效果的任意形状， 包括但不限于平面板、弧型板，如为平面板，板面和水平面的夹角为60 85度之间，优选75 度(如图5所示)。在使用时，将釜盖1、3与釜体2固定，反应釜按图1方向旋转90度，放 置到混合机上，按所需的反应时间进行反应。反应完毕后，利用可连接压缩空气釜盖4替代釜盖1、具有滤过功能的釜盖5替代 釜盖3(如图2所示)，釜盖5为焊接了不锈钢丝网7的不锈钢盖8(如图4所示)，其中不锈 钢丝网的规格可以根据具体的固液混合物分离的要求进行调整，一般规格为200-400目。 釜盖4的中间有一通气接头(如图3所示)，连接耐压硅胶管6。釜盖5的不锈钢盖8中间 有一通气接头(如图4所示)，方便滤液流出，也可以连接耐压硅胶管6。为了增加密闭效 果，防止在压滤过程中液体渗漏，同样地，在釜盖4和5与釜体2接触面的中央可以有圆形 凹槽，凹槽中可以放置起密闭作用的垫圈，一般选择聚四氟乙烯垫圈，外用阀兰将釜体和釜 盖固定。在使用时，将反应釜固定，釜盖4、釜盖5可以分别连接耐压硅胶管6，利用压缩空 气将固液混合物分离。如果需要利用液体对固体进行充分洗涤，可重复将釜盖1、3替换釜 盖4、5，将反应釜放置到混合机上，混合数分钟，然后进行压滤。上述操作可重复进行。本发明采用在上述反应釜中制备亲和层析介质的方法，可以将预处理一反应和/ 或反应一后处理过程在同一容器内进行，减少了反应前后产物需转移或处理过程中需要利 用更多容器的不便，同时也缩短了转移和处理时间，达到了省时、省力、不浪费材料的有益 效果。本发明采用的方法适合大规模制备亲和层析介质。采用在上述反应釜中制备亲和层 析介质，收获的介质可以达到几十公斤。
图1，反应釜在反应时的外观平面图；图2，反应釜在反应前进行预处理或反应结束后进行后处理时的外观平面图；图3，釜盖4的结构剖面图；图4，釜盖5的结构剖面图；图5，釜体2的横向结构剖面图；其中，1 釜盖、2 釜体、3 釜盖、4 釜盖、5 釜盖、6 硅胶管、7 不锈钢丝网、8 不 锈钢盖、9 导流板。图6，12% SDS-PAGE检测纯化产物图，其中Lanel =Marker ；Lane2_4 自制重组蛋白A亲和介质纯化抗Her2抗体。图7，SEC-HPLC检测纯化产物图。
具体实施例方式实施例1 利用反应釜制备亲和层析介质重组蛋白A :rPA50，R印Iigen公司。凝胶聚合琼脂糖凝胶Spharose FF，GE公司。 活化剂N-羟基琥珀酰亚胺。混合机W-600型，江阴市龙昌制药机械有限公司。亲和层析介质由重组蛋白A与活化的凝胶偶联而成，其中凝胶活化、活化的凝胶 与重组蛋白A偶联的反应过程均在本实用新型的反应釜中进行。活化反应前的预处理、活 化反应后的后处理、偶联反应前的预处理以及偶联反应后的后处理过程也均在本实用新型 的反应釜中进行。活化将S印harose FF加入反应釜中，使用釜盖4、5 (如图2所示)，用蒸馏水清洗 凝胶。然后更换釜盖1、3(如图1所示)，加入活化溶液(5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺，5g/L 的碳化二亚胺，0. 5g/L的Tween20，10mM磷酸钠盐缓冲液，pH 6.0)。将反应釜放置在混合 机上室温反应1小时。偶联更换釜盖4、5，用蒸馏水清洗凝胶(如图2所示)。然后更换釜盖1、3(如图 1所示)，加入偶联溶液(30g/L rPA50，0. 5g/L的Tween20, IOmM磷酸钠盐缓冲液，pH 7. 4)。 将反应釜放置在混合机上室温反应3小时。保存更换釜盖4、5 (如图2所示)，用蒸馏水清洗凝胶。将偶联后的凝胶保存于 20%的乙醇中。实验例动态载量(人免疫球蛋白)的比较自制的重组蛋白A亲和层析介质及GE公司rProteinA Sepharose Fast Flow装 柱，使用GE公司C10/10型层析柱，装至2mL ；层析系统为GE公司AKTAPurifier。平衡液(20mmol/LPB+250mmol/LNaClρΗ7· 0)，以 1. 5mL/min 流速平衡层析柱。人免疫球蛋白(伽玛莱士，上海莱士血制品有限公司)调节至2mg/mL，首先 bypass通过层析系统紫外检测器，读取样品的0D280记为A，并将样品流穿OD = A/10时， 已经通过层析柱的免疫球蛋白量定义为动态载量。样品以0. 6-1. 5mL/min的流速过柱，检测0D280，当0D280 = A/10时，停止上样，计 算此时流过层析柱的免疫球蛋白量，除以柱体积2mL，可以得出该柱的动态载量。洗脱液(20mmol/lcitrate, ρΗ3· 0)以 1. 5mL/min 流速过柱。
层析柱使用完毕，立即用注射用水，以1. 5mL/min流速冲洗层析柱。保存液(20%乙醇)以0. 8mL/min过柱，保存于2_8°C。自制重组蛋白A亲和层析介质动态载量测定结果为25. 3mg/mL,GE公司rProteinA Sepharose Fast Flow亲和层析介质动态载量测定结果为23. 2mg/mL，说明本发明方法制备 的亲和层析介质性质优良，完全可以替代现有同类商品。实施例2 利用自制的重组蛋白A亲和层析介质纯化重组抗Her2人源化单抗自制的重组蛋白A亲和层析介质装柱，使用GE公司C10/10型层析柱，装至2mL ； 层析系统为GE公司AKTA Purifier。平衡液(20mmol/LPB+250mmol/LNaCl ρΗ7· 0)，以 1. 5mL/min 流速平衡层析柱。重组抗Her2人源化单抗(Here印tin )无血清培养上清，以1. 5mL/min的流速过柱。平衡液(20mmol/LPB+250mmol/LNaCl, pH7. 0)以 1. 5mL/min 的流速过柱洗脱液 (20mmol/l citrate, pH3. 0)以 1. 5mL/min 流速过柱。收集λ 280处有紫外吸收的流出峰。层析柱使用完毕，用注射用水，以1. 5mL/min流速冲洗层析柱。保存液(20%乙醇)以0.8mL/min过柱，直到流出液有乙醇，关闭泵，层析柱保存于 2-8 "C。采用12% SDS-PAGE检测纯化产物(如图6所示)，结果显示采用本发明方法制备的亲和层析介质一步纯化抗体蛋白，其纯度高，重复性好。采用SEC-HPLC检测纯化产物(如图7所示)，结果同样显示采用本发明方法制备 的亲和层析介质一步纯化抗体蛋白，纯化效果好。
权利要求
一种制备亲和层析介质的方法，亲和层析介质由重组蛋白A与活化的凝胶偶联而成，其特征在于，凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应釜由釜体和釜盖组成，釜盖位于釜 体两端，在反应时，反应釜由釜体(2)、釜盖(1)和(3)组成，反应前预处理或反应后处理反 应物时，反应釜由釜体(2)、釜盖(4)和(5)组成。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下几步骤a.在活化或偶联反应时，将反应物质放入反应釜中，并将反应釜的釜盖(1)、(3)与釜 体(2)固定，然后将反应釜放置到混合机上进行反应，b.在活化或偶联反应前的预处理或反应结束后进行后处理时，将反应釜的釜盖(4)、 (5)与釜体(2)固定，将釜盖(4)、(5)分别连接耐压硅胶管(6)，利用压缩空气将固液混合 物分离，c.上述a、b操作可重复进行。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，反应釜的釜盖(4)的中间有一通气 接头，釜盖(5)为具有不锈钢丝网(7)的不锈钢盖(8)，所述不锈钢盖(8)的中间有一通气 接头，釜盖(4)、(5)通过通气接头连接耐压硅胶管(6)。
5.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，反应釜内设置导流板(9)，所述导 流板(9)是平面板或弧型板形状。
6.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，活化反应时间为1-24小时，偶联反 应时间为3-72小时。
7.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，活化反应所用的活化剂是N-羟基 琥珀酰亚胺。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，活化剂的浓度是l-10g/L。
9.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，偶联反应所用的重组蛋白A的浓度 是 1060g/L。
10.利用权利要求1至3任一所述方法制备的亲和层析介质的用途，用于纯化抗体蛋白。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，用于纯化抗Her2单克隆抗体。
12.利用权利要求1至3任一所述方法制备的亲和层析介质。
全文摘要
本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明公开了一种在反应釜中制备亲和层析介质的方法。该方法特征在于凝胶活化反应、活化的凝胶与重组蛋白A的偶联反应以及反应前预处理、反应后反应物的后处理过程均在同一反应釜中进行。该方法减少了反应前后产物需转移或处理过程中需要利用更多容器的不便，同时也缩短了转移和处理时间，达到了省时、省力、不浪费材料的效果。本发明还公开了利用上述方法制备的亲和层析介质纯化抗体蛋白的用途。
文档编号B01J20/30GK101797493SQ20091005686
公开日2010年8月11日 申请日期2009年2月6日 优先权日2009年2月6日
发明者侯盛, 寇庚, 张大鹏, 谈珉, 陶静 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司