专利名称：磁响应性极高吸附容量溶菌酶分子印迹纳米粒子制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术和新材料领域，涉及溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备，具体 涉及具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，此纳米粒子既 具有对溶菌酶的特异性吸附，又具有超顺磁性，可实现外界磁性作用下的快速分离，避免了 传统的复杂前处理程序。
背景技术：
溶菌酶(Iysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 (N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通 过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1，4糖苷键，使细胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带 负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具 有抗菌、消炎、抗病毒等作用。目前，溶菌酶已成为当前各领域关注的热点。在医学领域， 胃组织中溶菌酶的表达与胃癌的预后有十分密切的关系，血清中的溶菌酶与黑色素肿瘤免 疫、白血病分型有关；在生物医药领域，溶菌酶可用于抗菌消炎、增强免疫剂；在食品安全 领域，溶菌酶是一种抗菌保鲜的食品添加剂；因此，开展溶菌酶的提纯和检测具有十分重要 的现实意义。分子印迹技术，就是以目标分子为模板分子，将结构上具有互补的功能化聚合物 单体通过共价或非共价键与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成后通过 物理或化学方法将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列 功能团的交联高聚物。此类聚合物既保持了高聚物操作较简单，产率高，物理和化学稳定性 强，保存方便的优良特性，又具有生物抗体特有的亲和力和选择性，已成为当前目标物提纯 和净化的首先方法。此外，磁性材料的引入可以赋予仿生人工抗体以磁性，实现在保持其特 异性识别和专一性吸附特性的同时实现快速的磁分离，为分子印迹纳米粒子的应用提供一 个广阔的发展空间。目前，小分子的印记技术已趋于完善，而大生物大分子诸如蛋白、基因、细胞等的 分子印记技术处于起步阶段，依然面临极大的挑战。最大的难题是由于生物蛋白分子庞大， 构建的吸附位点较少，蛋白印迹的选择性不高。本发明拟利用纳米粒子比表面积大的特性， 将分子印迹薄膜紧密生长其上，并利用多种作用力构建出对溶菌酶特异性吸附的三维孔穴 结构，提高分子印迹聚合物的吸附容量，为大分子印记技术的发展提供一种思路，不仅具有 较高的学术价值，也具有很好的经济和社会价值。
发明内容
本发明的任务是提供一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米 粒子的制备方法，使其具有制备简单、成本低廉，制备出的溶菌酶分子印迹纳米粒子集特异 性吸附强、物理和化学稳定性高、可实现快速磁分离和反复回收利用等特点。
实现本发明的技术方案是本发明提供的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备 方法，包括以下步骤步骤一采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理，防止磁性纳米粒子相互 聚集；步骤二 在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO2薄膜；以提供活性基团(-0H)和 防止狗304磁性纳米粒子的氧化；步骤三对表面包被有二氧化硅SiA薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰 氧基修饰；磁性纳米粒子需要在其表面进行功能化修饰，以保证分子印迹膜的紧密生长；步骤四在包被有二氧化硅SiA薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子 表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜。上述步骤(一)所述的所述的采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理的方 法是将磁性纳米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性剂溶液中，所述的表面活性剂为柠 檬酸钠或油酸，使磁性纳米粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL，40 60°C条件下，反 应12 M小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳 米粒子的最终浓度达到lg/mL。本发明实施例使用的磁性纳米粒子是!^e3O4磁性纳米粒子， 购于南京工业大学纳米应用研究中心，磁性粒子的粒径为10-20nm，且具有超顺磁性。上述步骤(二 )所述的在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiA薄膜的方法是按 乙醇与水的体积比为5 1 3 2的比例配制乙醇和水的混合溶液，将磁性纳米粒子、氨 水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0.6 3的质量比加入到所配制的乙醇和水的混合 溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C条件下，反应12 24小时后，真空干燥，得到褐色粉末；上述步骤(三)所述的对表面包被有二氧化硅SiO2薄膜的磁性纳米粒子同时进行 巯基和丙烯酰氧基修饰的方法是；将等体积的Y-巯基丙基三甲氧基硅烷和Y-甲基丙烯 酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升纯水中含有5 μ L 10 μ L的Y -甲基 丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5 10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含 有20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性粒子的纯水中，60 100°C条件下，反应12 M小 时后，真空干燥，得到褐色粉末。上述步骤(四)所述的在包被有二氧化硅SiA薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰 的磁性纳米粒子表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜的方法是以溶菌酶为模板分子，在 适合的功能单体、交联剂、引发剂和表面包被了 SiO2并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁 性纳米粒子存在的条件下进行模板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极 高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子；所述的适合的功能单体是能够与磁性纳米粒子表 面修饰的丙烯酰氧基结合而固定在磁性纳米粒子表面的碱性功能单体丙烯酰胺或/和酸 性功能单体甲基丙烯酸；所述的交联剂是甲叉丙烯酰胺；所述的引发剂是过硫酸铵；其具 体操作方法是(1)将溶菌酶和碱性功能单体丙烯酰胺按摩尔比1000 1 3000 1的量加入到 0. 2 0. 5mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 5. 0 7. 0)中，使得溶菌酶的最终浓度为2mg/mL 6mg/mL,超声 5-lOmin ；
(2)在上述溶菌酶溶液中依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵、酸性功 能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅S^2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒 子，加入的量为交联剂甲叉丙烯酰胺与引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被 有二氧化硅SiO2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子的质量比依次为20 60 1 4 6 10 80，并使得交联剂甲叉丙烯酰胺与碱性功能单体丙烯酰胺的质量 比为1 6 1 10，制备成悬浮液，通氮气20 30min以除去氧气；(3)向制备成的悬浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在悬浮液中的浓度 为0. 5 2 μ L/mL,密封后，在常温条件下机械搅拌12 M小时后，依次采用0. 5 lmol/ L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸 附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。本发明方法操作简单，成本低廉，本发明方法制备的具有磁响应性和极高吸附容 量的溶菌酶分子印迹纳米粒子用于溶菌酶的提纯和检测，具有特异性吸附强、物理和化学 稳定性高、可反复回收利用等特点，大大提高对溶菌酶的吸附容量，并可实现快速的磁分 离，避免了传统方法前处理操作繁琐、步骤复杂的不足，可节约成本，降低蛋白的污染，为生 物大分子的净化和检测提供一种新方法。实验资料(1)磁性纳米粒子的分散及效果检测具体的制备步骤将!^e3O4磁性纳米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性剂溶液 中(柠檬酸钠或油酸)，使磁性纳米粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C条 件下，反应12 M小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使 磁性纳米粒子的最终浓度达到lg/mL。由图I(A)显示磁性纳米粒子在常规条件下相互聚集。如果能对磁性纳米粒子进 行分散，就可以获得粒径较小、比表面积更大的磁性纳米粒子，最终提高印迹粒子的吸附容 量。图I(B)显示分散后的磁性纳米粒子粒径较小、分布均一。(2)磁性粒子表面SW2薄膜的包被及验证具体的制备步骤将!^e3O4磁性纳米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0. 6 3的质量比加入到含有乙醇/水(5/1 3/2，V/V)的混合溶液中，使磁性纳米 粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C条件下，反应12 M小时后，真空干 燥，得到褐色粉末；红外谱图显示(图2)在1105. 1和952. 8波长处可见Si_0_Si的偏振峰，同时在 468. 7波长处可见 ^-0偏振峰，证明SW2薄膜已经包被在磁性颗粒表面。由于!^e3O4磁性纳米粒子极不稳定，容易被氧化而丧失超顺磁性。因此，SiO2薄膜 的包被，一方面可以保护狗304，另一方面可以提供活性基团-0H，为以后磁性粒子表面基团 修饰提供了可能。(3)磁性粒子表面巯基和丙烯酰氧基的同时修饰及检验具体的制备步骤首先将等体积的、-巯基丙基三甲氧基硅烷和、-甲基丙烯酰 氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升水中含有5μ L IOyL的γ -甲基丙 烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5 10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含有 20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性粒子的纯水中，60 100°C条件下，反应12 M小时后，真空干燥，得到褐色粉末；红外谱图显示(图2)在1105. 1和952. 8波长处Si_0_Si的偏振峰的增宽， 1720. 4波长处C = 0偏振峰的出现，证明丙烯酰氧基已经修饰在磁性纳米粒子表面。同时，通过巯基特征性显色反应(Ellman反应，反应方程式如下)和图3(A)证明 巯基已经结合在磁性纳米粒子表面；
权利要求
1.一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征 在于，包括以下步骤步骤一采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理；步骤二 在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅S^2薄膜；步骤三对表面包被有二氧化硅S^2薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基 修饰；步骤四在包被有二氧化硅S^2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子表面 生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜。
2.根据权利要求ι所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子 的制备方法，其特性在于，所述的磁性纳米粒子是!^3O4磁性纳米粒子。
3.根据权利要求1或2所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米 粒子的制备方法，其特性在于，采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理的方法是将 磁性纳米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性剂溶液中，所述的表面活性剂为柠檬酸钠或 油酸，使磁性纳米粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL，40 60°C条件下，反应12 M 小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳米粒子的最 终浓度达到lg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米 粒子的制备方法，其特性在于，在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO2薄膜的方法是将磁 性纳米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0.6 3的质量比加入到含有乙醇/ 水(5/1 3/2，V/V)的混合溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度为0. 01g/mL 0. lg/mL, 40 60°C条件下，反应12 M小时后，真空干燥，得到褐色粉末。
5.根据权利要求1或2所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒 子的制备方法，其特性在于，对表面包被有二氧化硅SiO2薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯 基和丙烯酰氧基修饰的方法是；首先将等体积的Y-巯基丙基三甲氧基硅烷和Y-甲基丙 烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升水中含有5 μ L 10 μ L的Y -甲基 丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5 10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含 有20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性纳米粒子的纯水中，60 100°C条件下，反应12 24小时后，真空干燥，得到褐色粉末。
6.根据权利要求1或2所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒 子的制备方法，其特性在于，在包被有二氧化硅SiO2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁 性纳米粒子表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜的方法是以溶菌酶为模板分子，在适合 的功能单体、交联剂、引发剂和表面包被了 SiA并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳 米粒子存在的条件下进行模板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极高吸 附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子 的制备方法，其特性在于，所述的适合的功能单体是能够与磁性纳米粒子表面修饰的丙烯 酰氧基结合而固定在磁性纳米粒子表面的碱性功能单体丙烯酰胺或/和酸性功能单体甲 基丙烯酸，所述的交联剂是甲叉丙烯酰胺，所述的引发剂是过硫酸铵。
8.根据权利要求7所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特性在于，所述的以溶菌酶为模板分子，在适合的功能单体、交联剂、引发剂 和表面包被了 S^2并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子存在的条件下进行模 板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳 米粒子的具体方法是(1)将溶菌酶和碱性功能单体丙烯酰胺按摩尔比1000 1 3000 1的量加入到 0. 2 0. 5mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 5. 0 7. 0)中，使得溶菌酶的最终浓度为2mg/mL 6mg/mL,超声 5-lOmin ；(2)在上述溶菌酶溶液中依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵、酸性功能 单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒 子，加入的量为交联剂甲叉丙烯酰胺与引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被 有二氧化硅SiO2薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子的质量比依次为20 60 1 4 6 10 80，并使得交联剂甲叉丙烯酰胺与碱性功能单体丙烯酰胺的质量 比为1 6 1 10，制备成悬浮液，通氮气20 30min以除去氧气；(3)向制备成的悬浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在悬浮液中的浓度为 0. 5 2 μ L/mL,密封后，在常温条件下机械搅拌12 M小时后，依次采用0. 5 lmol/L 的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附 容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。
9.权利要求1至8中任一项所述方法制备的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分 子印迹纳米粒子。
10.权利要求9所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子在溶 菌酶的提纯或检测中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，它是以溶菌酶为模板分子，在适合的功能单体、交联剂、引发剂和其表面包被了SiO2并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子存在的条件下进行模板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子，本发明还提供了该纳米粒子的制备方法。本发明制备的溶菌酶分子印迹纳米粒子具有吸附容量高、制备简单、成本低廉、特异性吸附强、物理和化学稳定性高、可反复回收利用等特点。
文档编号B01J20/286GK102145279SQ20101011123
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者周宜开, 戴晴, 梅素容, 荆涛, 郝巧玲 申请人:华中科技大学