专利名称：一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种固相萃取柱的制备方法，尤其涉及一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法。
背景技术：
近年来,香 素类杀鼠剂[如氯杀鼠灵(3_ ( α -对氯苯基-β -乙酸乙基)-4-轻基香豆素)，杀鼠灵(3-( I-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素)]作为第一代抗凝血类杀鼠剂，因其具有高效、广谱、适口性好等特点，至今依然是野外及室内灭鼠的主要鼠药。但由于使用与管理上的不够完善，大人和小该误食、自杀服毒及投毒案例常有发生。鉴于此，开展痕量香豆素类杀鼠剂的富集净化与检测技术研究有利于促进卫生检验技术的进步。针对香豆素类杀鼠剂的检测，样品的富集净化技术是其分析监测的关键步骤。目前，香豆素类杀鼠剂样品预处理的常用方法主要有液液萃取和固相萃取两种。固相萃取比液液萃取富集效率高、消耗有机溶剂少、操作简单和易于自动化等优点。然而，传统的固相萃取小柱一般采用硅胶键合C18填料、改性二氧化硅、三氧化二铝等作为填料，如谭家镒等报道了(谭家镒，姜兆林，吴玉红.分析科学学报，1999，15，229.)采用⑶Χ101、⑶Χ201、⑶Χ301、⑶Χ403、⑶Χ501、XAD-2等聚合树脂作为固相萃取材料用于富集净化杀鼠迷与杀鼠灵等香豆素类杀鼠剂，Jin等报道了采用Oasis HLB固相萃取小柱(M. C Jin, X. HChen, Y. Zhu. J. Chromatogr. Α, 2007, 1155: 57)富集净化杀鼠灵、杀鼠醚和氟鼠灵等。尽管这些填料在富集净化香豆素类杀鼠剂时也取得了较好的效果，但其富集净化条件较为苛刻、选择性相对较差，不利于普及推广。因此，设计对香豆素类杀鼠剂具有高选择性和高富集倍数的固相萃取小柱对于其富集净化与检测技术的进步具有十分重要的现实意义。分子印迹聚合物(MIP)作为一种新兴的富集净化材料，已在分析检测的样品前处理中得到了广泛的应用。但现有分子印迹聚合物的制备主要集中在兽药和环境雌激素等残留物中，如R. Zhu 等报道的(R. Zhu, W. H. Zhao, M. J. Zhai, et al. Anal. Chim.Acta, 2010, 658，209.)以双酚A为模板分子、二氧化硅为载体的用于富集分离污水中双酚A的纳米级分子印迹聚合物。关于香豆素类杀鼠剂的分子印迹固相萃取柱的制备方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法。本发明制备工艺简单、专一性选择性强、富集效率高；所制备的香豆素 类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱对水样和食品样品中残留的微量香豆素类杀鼠剂具有很高的选择性和极强的富集能力，并且可以显著降低基质效应。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法，该方法包括以下步骤(I)将10(T500mg香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后,超声5 30min至混合均勻,移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，装填均勻后，两端分别用筛板封堵。
(2)将10(T500mg传统固相萃取填料与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后，超声5 30min至混合均匀，移至步骤I的固相萃取小柱中，装填均匀后，顶端用筛板封堵，用5"20mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用5 20mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质。(3)将步骤2的固相萃取小柱用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，然后3(T90°C真空干燥广24小时，制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱。本发明的有益效果是本发明所制备的香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱，具有制备工艺简单、专一选择性强、富集效率高的优点，并将其应用于富集生活饮用水及食品中残留的痕量香豆素类杀鼠剂，能达到较高的富集倍数并可有效的降低基质效应。
图I是根据本发明实施例，得到两种香豆素类杀鼠剂的多反应监测(MRM)色谱图，图中，I为杀鼠灵；2为氯杀鼠灵。
具体实施例方式本发明香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤
I、将10(T500mg香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后,超声5 30min至混合均勻,移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，装填均勻后，两端分别用筛板封堵。香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物优选为粉末状。香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物可以通过以下步骤制备得到
(I)、制备富含环氧基的单分散聚合物复合微球在80°C条件下，聚合单体、功能单体与交联剂在引发剂的作用下，经悬浮聚合反应制备得到含有环氧基的单分散聚合物复合微球；
该步骤具体为依次量取1.0-20. OmL环氧基功能化单体、2. 0-10. OmL聚合单体、0-4. OmL交联剂，并将其加入到50. 0-500. OmL分散剂中，60°C下超声分散I. 0-10. O分钟；然后加入O. 5-5. Og引发剂，在60-90°C，搅拌速度为300-900转/分钟，恒温恒速机械搅拌，反应O. 5-5. O小时后，用乙醇洗涤数次至pH为6-8，30-90°C真空干燥1_24小时，制得富含环氧基的单分散聚合物复合微球。分散剂为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙二醇中的至少一种。聚合单体为烷基丙烯酸酯、苯乙烯及其取代物中的至少一种，进一步优选为甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯中的至少一种。环氧基功能化单体为烷基丙烯酸缩水甘油酯中至少一种；进一步优选为甲基丙烯酸缩水甘油酯或乙基丙烯酸缩水甘油酯。交联剂为二乙烯基苯、双丙烯酰胺及其取代物、烷基丙烯酸乙二醇及其酯交联剂中的至少一种；进一步优选为二乙烯基苯、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺交联剂中的至少一种。引发剂为过氧化二酰、偶氮二异腈类化合物中至少一种，优选偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过甲氧基苯甲酰中至少一种。(2)、制备模板分子与氨基功能基团的复合反应液在60°C条件下，在甲醇体系中，模板分子与功能基经氢键作用力相互结合，形成模板分子与氨基功能基团的复合反应液。该步骤具体为将2. 0-10. Og模板分子和氨基功能试剂5. 0-20. OmL加入到50-500. OmL反应溶剂中，超声分散I. 0-10. O分钟，在30_80°C条件下，搅拌速度为100-600转/分钟，恒温磁力搅拌反应2. 0-6. O小时，制得模板分子与氨基功能基团的复合反应液。模板分子为香豆素类化合物中的至少一种，优选氯杀鼠灵与杀鼠灵中的至少一种。氨基功能试剂为烷基多胺、醇胺、脂环胺类化合物中的至少一种，优选乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺中至少一种。反应溶剂可以是无水乙醇、无水甲醇、醇水混合液中的至少一种，进一步优选为无水甲醇。(3)、制备香豆素类杀鼠剂氨基功能化分子印迹复合材料步骤(I)和步骤(2)所得产物经开环反应对材料进行表面功能化修饰，最终得到具有核-壳结构的香豆素类杀鼠剂氨基功能化分子印迹复合材料。该步骤具体为称取O. 5-10. Og步骤(I)所制得环氧基功能化聚合物复合微球，力口入到步骤(2)所制得模板分子与氨基功能基团的复合反应液体系中，超声分散I. 0-10. O分钟，在30-80°C条件下，搅拌速度为100-600转/分钟，恒温磁力搅拌反应6. 0-12. O小时后，用超纯水洗涤数次至PH为6-8，再用甲醇超声洗涤数次至模板分子不被检出，30-90°C真空干燥1-24小时，制得具有核壳结构的香豆素类杀鼠剂氨基功能化分子印迹复合材料。2、将10(T500mg传统固相萃取填料与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后，超声5 30min至混合均匀，移至步骤(I)的固相萃取小柱中，装填均匀后，顶端用筛板封堵，用5 20mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用5 20mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质。传统固相萃取填料可以是硅胶键合C18填料、改性二氧化硅、三氧化二铝和PSA中的至少一种，进一步优选为粉末状硅胶键合C18填料。香豆素类杀鼠剂氨基功能化分子印迹聚合物与传统固相萃取填料的质量比为酸性有机溶剂可以是甲酸、乙酸和三氟乙酸中的至少一种与甲醇的混合溶液，酸与甲醇的体积比为1:5-1:20 ;进一步优选为甲酸与甲醇的混合溶液；甲酸与甲醇的体积比为 1:5-1:20。纯有机溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一种，进一步优选为甲醇。3、将步骤2的固相萃取小柱用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，然后3(T90°C真空干燥广12小时，制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱。本发明所制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的性能评价通过对实际样品的检测对香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的性能进行评价。采用不同比例的甲醇-水溶液和甲酸-甲醇溶液对固相萃取柱进行清洗，分别对淋洗和洗脱条件进行优化，并与普通SPE柱富集净化效果进行比较。结果表明本发明所制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱对目标分析物的富集倍数为50-500倍，香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱在使用10次之后，对样品中残留的痕量香豆素类杀鼠剂仍具有高的选择性和富集能力，其回收率大于93. 8%。 下面结合附图及具体实施例对本发明的内容做进一步说明，使本发明的优势和有益效果更加突出，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例I香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备
(1)将IOOmg香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物与IOmL纯有机溶剂混合，振荡IOmin后超声IOmin至混合均匀，移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，两端分别用筛板封堵； (2)将500mg传统固相萃取填料与IOmL纯有机溶剂混合,振荡IOmin后超声IOmin至混合均匀，移至步骤(I)所得固相萃取小柱中，装填均匀后顶端用筛板封堵，用IOmL酸性有机溶剂上柱清洗,然后用IOmL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质；
(3)将步骤(2)所得固相萃取用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，30°C真空干燥12小时，制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱。香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的性能评价
(I)先后用5mL水和甲醇对香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱进行活化，之后将500mL河水过滤后上样，流速为I. OmL/min,用6mL甲醇与水(1:10 V/V)的混合溶液淋洗，再用IOmL甲醇与甲酸(I: 10 V/V)的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，采用超快速液相色谱-串联质谱仪(UFLC-MS/MS)进行分析。(2)先后用5mL水和甲醇对香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱进行活化，之后将5mL经蛋白沉淀的全血样品上样,流速为I. OmL/min,用6mL甲醇与水(I: 10 V/V)的混合溶液淋洗，再用IOmL甲醇与甲酸(I: 10 V/V)的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至ΙΟΟμ ，采用超快速液相色谱-串联质谱仪(UFLC-MS/MS)进行分析。实施例21操作步骤同实施例1，实施例Γ8原料物质、原料配方及制备条件参数见表I。表I :本发明实施例f 10原料组分及制备参数
| 臟制廳II I
I 号I 2 3456*8
養=豆素类杀鼠_分 100 200 3CM) JOO 丨 5CW 100 IW 100 I
I Λ +子Φ迹聚合物CilIg)
I 粉末状職职填观)400 m 200 100
.__料(IIIg)_________J
j c 改性二氧化■ (IIIg)_________I
I Cl 三氧化二铝 Cmg)________5CH) I
I eP.SA (mg)________ 300 I
本发明应用香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱对水中杀鼠灵与氯杀鼠灵进行富集净化。分别准确称取杀鼠灵与氯杀鼠灵标准品10. Omg于6个IOmL容量瓶中，用少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，制成I. Og/L的标准储备液，在4°C冰箱中保存备用。采用上述各香豆素类杀鼠剂标准储备液配置浓度为O. 05μ g/L的混合标准溶液5(T500mL，流速为I. OmL/min,用6mL甲醇与水(1:10, V/V)的混合溶液淋洗,再用IOmL甲醇与甲酸(1:10, V/V)的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，采用超快速液相色谱-串联质谱仪(UFLC-MS/MS)进行分析，结果如图I所示。结果表明采用本发明制备的香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱，其对上述香豆素类杀鼠剂的富集倍数为5(Γ500倍，是有效富集水样中香豆素类杀鼠剂的潜在固相萃取柱。色谱条件
色谱柱X_Bridge C18 柱(150mmX2. Imm i. d.，5 μ m);流速0· 4mL/min ;进样量5. OyL ;流动相A相内含0.1%甲酸水溶液，B相内含0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序:0 3· OOmin, 10. 0% A ；3. 01 6. OOmin, 40. 0% A。质谱条件
离子源电喷雾离子源；扫描方式负离子扫描；定量检测方式多反应监测模式(MRM);电喷雾电压(IS):4500V ;雾化气压力(GSl):344. 8kPa (50. Opsi);辅助气流速(GS2):344. 8kPa (50. Opsi);气帘气压力(CUR) 275. 9kPa (40. Opsi);碰撞气(CAD) 41. 4kPa(6. Opsi);离子源温度(TEM) 500°C ;扫描时间20mS ;碰撞室出口电压(CXP) 10. OV ;碰撞室入口电压(EP) 10. OV ;Q1/Q3离子对、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)见表2。表2、杀鼠灵和氯杀鼠灵的Q1/Q3离子对、去簇电压、碰撞能量及其保留时间
—化合物——母离子...............................子离子—......表轉樂压—...碰撞能量I......保留时间..
__(Ql, m/z') (,QXm/z)__(V)__(ev)__(nan)
系鼠灵 3l.r.3 WLO 丨-110 -25
25CU)-110 -30
IlCi^-HO -42
氧杀鼠灵 341J 2S5.01*115 -32
K>U；i*115 -2 S __ 11 "O-113 -49__
注:*定量离子。本发明所述香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱，通过实验证明该发明制备工艺简单，成本低廉，得到的香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱分布均勻，性质稳定；对水及生物样品中残留的痕量杀鼠灵与氯杀鼠灵具有良好的富集作用。实施例9 :制备香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物
I、称取2. Og聚乙烯醇217于500. OmL超纯水中，加热溶解，以此作为分散剂；将聚合单体甲基丙烯酸甲酯(4. OmL)、功能化单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(4. OmL)、交联剂二乙烯基苯(2. OmL)，在搅拌下依次滴加到反应体系中，60°C下超声分散5. O分钟，使反应体系分散均匀。将I. Og过甲氧基苯甲酰引发剂溶解在20. OmL热乙醇溶液中，在80 800转/分钟的转速下，滴加到上述反应体系中，恒温恒速反应3. O小时，先后用超纯水和乙醇洗涤数次，60°C真空干燥12小时，制得环氧基功能化聚合物复合微球。2、分别称取2. Og模板分子和10. OmL氨基功能试剂，并将其加入到100. OmL甲醇反应介质中，超声分散2. O分钟，在60°C条件下，搅拌速度为400转/分钟，恒温磁力搅拌反应3. O小时，制的模板分子与氨基功能基团的复合反应液；
3、称取2. Og步骤(I)所制得环氧基功能化聚合物复合微球，加入到步骤(2)所制得模板分子与氨基功能基团的复合反应液体系中，在步骤(2)的反应条件下，继续反应8. O小时后，用超纯水洗涤数次至pH为6-8，再用甲醇超声洗涤数次至模板分子不被检出，60°C真空干燥12小时，制得具有核壳结构的香豆素类杀鼠剂氨基功能化分子印迹复合材料。
本发明的上述实施方案是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)将10(T500mg香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后,超声5 30min至混合均勻,移至聚丙烯等材质的固相萃取空柱中，装填均勻后，两端分别用筛板封堵； (2)将10(T500mg传统固相萃取填料与5 20mL纯有机溶剂混合，振荡5 30min后，超声5 30min至混合均匀，移至步骤I的固相萃取小柱中，装填均匀后，顶端用筛板封堵，用5"20mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用5 20mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质； (3)将步骤2的固相萃取小柱用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，然后3(T90°C真空干燥广12小时，制得香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)和(2)中，所述纯有机溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯有机溶剂优选为甲醇。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述传统固相萃取填料可以是硅胶键合C18填料、改性二氧化硅、三氧化二铝和PSA中的至少一种；所述香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物与传统固相萃取填料的质量比为1:1-1:5。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述传统固相萃取填料进一步优选为粉末状硅胶键合C18填料。
6.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述酸性有机溶剂可以是甲酸、乙酸和三氟乙酸中的至少一种与甲醇的混合溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸性有机溶剂进一步优选为甲酸与甲醇的混合溶液；甲酸与甲醇的体积比为1:5-1:20。
全文摘要
本发明公开了一种香豆素类杀鼠剂分子印迹固相萃取柱的制备方法，该方法依次将香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物100-500mg与传统固相萃取填料100-500mg分别与5-20mL纯有机溶剂混合均匀，依次移入固相萃取空柱中，并用筛板封堵两端，装填均匀后用酸性有机溶剂上柱清洗，然后用纯有机溶剂冲洗，并用惰性气体吹扫除去残余有机溶剂，干燥即得。本发明制备方法简单，具有与香豆素类杀鼠剂分子印迹聚合物本身匹配的特殊性，所制备的固相萃取柱对香豆素类杀鼠剂具有很高的选择性和回收率，并且可以明显降低基质效应。
文档编号B01J20/26GK102631902SQ20121010723
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者赵永纲, 金米聪, 陈晓红 申请人:宁波市疾病预防控制中心