专利名称：一种可调控释放速率的杀菌微胶囊悬浮剂及其制备和使用方法
技术领域：
本发明属于生物农药加工与应用技术领域，具体涉及一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊及其悬浮剂以及它们的制备和使用方法。
背景技术：
那他霉素(Natamycin,NA)是纳他链霉菌(Streptomycesnatalensis)、利迪链霉菌AOl (Sotrytis Iydicus)(中国专利:200710187435. I)等链霉菌的次生代谢产物，属于抗生素类抗真菌剂。NA具有广谱、高效、安全、不易获得抗性等优点，目前已在饮料、饲料、食品及医药领域广泛应用，但在农业生产上仅限于防治棉花和豆类的种菌病害。这是 由于NA的分子结构属于多烯大环内酯，其在水溶液中易受紫外线影响而光解，从而限制了它在防治植物地上部病害的应用(卢向阳等.6种光稳定剂对那他霉素抗光解的影响.农药，2011，50(8):570-572)。目前，国内外克服药物光解的主要方法有分子结构改造、添加光稳定剂和微胶囊化，但前者耗资耗时巨大，而添加光稳定剂的方法也不够理想。微胶囊(MC)技术是一种用成膜材料将活性物质作为囊芯包覆起来形成微小粒子的技术，在医药、涂料、食品、纺织、日化、农业等行业中已被广泛应用(宋健等，微胶囊化技术及应用.化学工业出版社，2001，234-379)。MC具有抑制因环境因素(如光、热、空气、雨水、土壤、微生物)造成囊芯活性成分的分解和流失，提高药剂本身稳定性的功能(高德霖，微胶囊技术在农药剂型中的应用，现代化工，2000, 20(2) : 10-14)。鉴于以上情况，以微胶囊化来解决NA的光解问题具有较大潜力。郑雅婧等证实复凝聚法制备的那他霉素MC具有良好的抗光解作用(郑雅婧等.那他霉素微胶囊的制备及性能测试.农药2012，51(4):267-269)，但是复凝聚法所制备的MC释放速率快慢难以调控，不能针对植物病害速效性或持效性的要求加以调节，从而造成病害不能及时控制或控制时间较短的问题。为此研制一种可调控释放速率MC的制备方法十分必要，而采用层层组装(LBL)微胶囊的方法正是解决这一问题的良好途径。Caruso等最早利用LBL实现了小分子量物质的包囊(CARUSO F，YANG W，TRAUD. Microencapsulation ofUncharged Low Molecular Weight Organic Materials byPolyelectrolyteMultilayer Self-assembly[J]. Langmui, 2000, 16:8932-8936)。经典的LBL技术是以静电作用为驱动力的。LBL可以通过控制囊壁的层数等手段来调控农药的释放行为。目前，LBL已被应用于一些农药(如阿维菌素、吡虫啉等)的微胶囊化研究，但尚缺乏LBL组装体系繁杂影响因素的系统研究，组装体系最佳条件的确定比较困难。另外，LBL技术应用于诸如那他霉素这类具有两性分子特性的生物农药未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊及其悬浮剂以及它们的制备和使用方法，以天然阴离子电解质海藻酸钠和天然阳离子电解质壳聚糖为壁材，通过LBL技术将芯材那他霉素包覆起来。由于在制备过程中可以通过组装层数来调控MC的释放速率，因此较其它MC制备方法具有理想的释放速率，能满足药剂所需的速效性和持效性，获得更好的防病效果。同时也能较好地克服那他霉素的光下易分解的问题，达到可用于防治植物表面真菌病害的作用。本发明提供了 NA微胶囊的制备方法。为了利用LBL技术实现多层微胶囊的高质量组装及连续组装，本发明采用正交试验对MC的最内层(第一层)、第二层(或偶数层)和第三层(或奇数层)的反应体系条件进行了探索，获得了制备NA微胶囊的优化工艺条件。采用本发明制备的NA微胶囊具有较高的载药量，4层MC载药量可达76. 46%(质量比)，8层MC载药量可达73. 54%(质量比)；以纯水为释放介质，释放72h后NA原粉、4层MC、8层MC的累积释放率分别为5. 96%,4. 10%和I. 95% (质量百分比)，与NA原粉相比，4层MC和8层MC的累积释放率分别降低O. 45倍和2. 06倍，具良好的缓释性能。与同浓度的NA浓缩液相比，4层MC和8层MC加药48h对灰霉病菌的相对活性分别为94. 1%和92. 9%(以浓缩液活 性100%计)，说明4层MC和8层MC具有良好的通透性和速效性；在紫外光下，4层MC和8层MC相对活性下降50%的时间分别为83. 57和84. 09min,较NA浓缩液分别提高了 3. 19和3. 21倍，说明它们具有良好的抗光解性能。一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊的制备方法，微胶囊的组装层数可以根据防治对象或使用方法各不相同，可以从I层到数十层，甚至更多层；组装步骤如下I)将那他霉素分散于去离子水中制得悬浮液，将悬浮液超声波细化处理5-10min，获得20-40g/L的那他霉素均匀水悬浮液A ；2)组装第一层在搅拌下向步骤I)获得的悬浮液A中加入海藻酸钠溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10_20g/L，海藻酸钠含量为O. 75-1. 75g/L, Tween-80的含量为7. 5-12. 5g/L，氯化钠含量为10_18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3. 5-5. 5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液Al ；3)组装第二层用3g/L乙酸配制出浓度为I. 5-3. 5g/L的壳聚糖溶液，在搅拌下向步骤2)获得的悬浮液Al中加入上述壳聚糖溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10_20g/L，壳聚糖含量为O. 75-1. 75g/L，Tween-80的含量为2_3g/L,氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至2. 0-4. O,反应15_20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A2 ；4)组装第三层在搅拌下向步骤3)获得的悬浮液A2中加入海藻酸钠溶液、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10_20g/L，海藻酸钠含量为1.25-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3. 5-5. 5，反应15_20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A3 ；重复上述步骤，逐层吸附海藻酸钠和壳聚糖，直至分别得到所需包裹层数的那他霉素微胶囊，继续组装时，偶数层按照步骤3)的条件操作，奇数层按照步骤4)的条件操作，从第二层开始均使用上一步骤获得的那他霉素含量为20_40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液来提供那他霉素，从而进行交替组装和包覆，直至组装到需要的层数，组装完成后保存最终的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液备用。本发明还提供了那他霉素微胶囊悬浮剂(NACS)的制备和使用方法。药效试验表明，不同组装层数的微胶囊持效期不同，与不施药的对照组相比，采用8层NA微胶囊剂和4层NA微胶囊剂各100mg/L防治番茄灰霉病，用药后21天的防效分别为68. 14%和53. 80%，两种NACS的防治效果均优于未经包囊的NA浓缩液(防效为11. 17%)和复凝聚法制备的微胶囊剂(防效为46. 65%)。抑菌试验表明，NA具有广谱杀菌性，可以有效地防治植物的20余种真菌病害。所述的那他霉素微胶囊悬浮剂的制备方法为，微胶囊组装完成后，取微胶囊均匀水悬浮液，添加农药助剂后搅拌均匀即得到那他霉素微胶囊悬浮剂，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分那他霉素O. 5% 5. 4% ;微胶囊壁材海藻酸钠O. 1% 3. 0% ;微胶囊壁材壳聚糖O. 1% 3. 0% ;抗沉剂O. 5% 10% ;表面活性剂O. 5% 10% ;余量为水。所述抗沉剂(又称增稠剂或悬浮稳定剂)选自聚丙烯酸钠、膨润土、硅酸镁铝中的 一种或多种。所述表面活性剂选自0P-10、TX-10、Tween-20和Tween-80的一种或多种。微胶囊悬浮剂的组分还包括如下组分中的一种或多种，分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂，其使用剂量为本领域常规剂量。其中，分散剂选自木质素磺酸钠、NNO、MF等；防冻剂选自乙二醇、丙二醇、甘油、尿素等；消泡剂选自消泡剂GPE (敌泡)、聚醚类消泡剂7010等、有机硅酮类、CS 10的脂肪醇、ClO 20饱和脂肪酸及其酯类、酯-醚型化合物等；pH调节剂选自醋酸、盐酸、氢氧化钠等。所述NACS优选包含下列质量百分比的组分那他霉素1% 5% ;海藻酸钠O. 2% 2% ;壳聚糖O. 2% 2% ;抗沉剂1% 8% ;表面活性剂1% 5% ;余量为水。所述NACS的防治对象为真菌病害，所述病害为番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、辣椒灰霉病(Botrytis cinerea)、爺子灰霉病(Botrytis cinerea)、葡萄灰霉病(Botrytis cinerea)、玉米大斑病(Exserohilumturcicum)、瓜果腐霉病(Pythiumaphanidermatum)、爺子早疫病(Alternaria solani)、小麦纹枯病(Rhizoctoniacerealis)、小麦赤霉病(Fusarium graminearum)、稻痕病(Pyricularia oryzae)、豌豆根腐病(Fusarium solani f. sp. pisi )、番爺叶霉病(Cladosporium fulvum)、西瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、黄瓜枯萎病(Fusariumoxysporum f. sp.cucumerinum)、百合根腐病(Rhizoctonia solani )、李子褐腐病(Monilinia fructicola)、
(Monilinia fructicola)> ^ (Fusarium oxysporum f. sp. persica)>芳:菜斑枯病(Septoriaapii)、辣椒炭疽病(Colletotrichum capsici)、甘蓝枯萎病(Fusariumoxysporum Schl. f. sp. conglutinans)、苹果轮斑病(Alternaria mali)、棉花黄萎病(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum)等，但不局限于上述真菌病害。本发明所述那他霉素微胶囊悬浮剂的使用方法，具体操作步骤如下在植物发病之前或发病初期，按NA的使用浓度25 250mg/L，将微胶囊悬浮剂兑水配制成稀释液，采用喷雾法将其喷洒于植物表面。上述的植物表面是指植物的叶、茎和果实的表面等地上部组织。本发明具有以下优点
(I)采用LBL法制备的NA微胶囊，组装层数任意可调，可以制备出任何释放速率快慢的微胶囊。(2)制备反应条件温和，不会造成活性成分NA因高温而分解失效；(3)具有良好的抗光解作用，与未经包囊的NA浓缩液相比，组装4层的MC和组装8层的MC分别可提高抗光解能力3. 19倍和3. 21倍，因此在紫外光照下可显著提高防病效果;(4)微胶囊内的活性成分具有良好的缓释作用，较常规制剂具有较长的持效性；(5)微胶囊囊壁具有良好的通透性，较合成高分子化合物作囊壁的微胶囊具有更好的抑菌速效性；(6)制备出的微胶囊产品粒径较复凝聚法小，90%颗粒粒径在I 20微米，有利于 制备出良好物理性能的农药制剂，并适宜于农药的喷雾要求。(7)为作物生产，尤其是蔬菜生产，提供了安全的生物农药品种，保障了人民的身体健康。
图I为那他霉素层层组装电势反转示意2为NA浓度与吸光值的标准曲线图3不同组装层数那他霉素微胶囊在水中的释放曲线
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下是实施例中涉及的菌种、原料、试剂、药剂和设备I、供试菌株植物病原真菌棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)、番爺灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)、爺子灰霉病菌(Botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)> 瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)、爺子早疫病菌(Alternaria solani )、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、稻痕病菌(Pyricularia oryzae)、豌豆根腐病菌(Fusarium solani f. sp. pisi)、番爺叶霉病菌(Cladosporiumfulvum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. cucumerinum)、百合根腐病菌(Rhizoctonia solani)、李子褐腐病菌(Monilinia fructicola)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、桃枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. persica)、芳:菜斑枯病菌(Septoria apii)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.f. sp.conglutinans)、苹果轮斑病菌(Alternaria mali)。酵母菌啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。以上植物病原真菌是由中国农业大学植物病理学系和北京市农林科学院植环所提供，啤酒酵母菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。
2、供试培养基PDA培养基马铃薯200g，洗净切成lcm3小块煮沸约30min后用四层纱布过滤，滤液用蒸懼水补足至1000ml,加葡萄糖20g,琼脂15g, 121° C灭菌30min。3、供试药剂和试剂 药剂91· 7%那他霉素标准品(USP) ;I. 408g/L NA浓缩液(利迪链霉菌次生代谢产物，制备方法参照中国专利200710187435. I);纯度为95. 8% (质量比)那他霉素原药(原粉)(北京东方瑞德生物技术有限公司)，I. 4%NA微胶囊悬浮剂(复凝聚法制备方法见中国专利201110388140. 7，简称 NACS-复)。试剂海藻酸钠(CP，温州助剂厂)；壳聚糖(CP)、甲醇(AR)(国药集团化学试剂有限公司)；99· 8%NaCl。
4、农药助剂抗沉剂羧甲基纤维素(CMC)、聚丙烯酸钠(分子量3X107)、硅酸镁铝；表面活性剂Tween-20、Tween-80、0P-10、TX-10 ;分散剂木质素磺酸钠、萘磺酸甲醛缩合物(如NN0、MF等)；抗冻剂乙二醇、丙二醇、甘油、尿素；消泡剂敌泡、7010。5、仪器和设备DU800可见-紫外分光光度计(美国BECKMAN)、JY92-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、800型台式离心机(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、生物显微镜(日本OLYMPUS)、STARTER-3C pH计(上海奥豪斯仪器有限公司)、超净工作台(带20W紫外灯)、1. 5升喷雾器；TES-1339型照度计(泰仕电子工业股份有限公司)、透析袋MD55-14 (截留分子量14000) ；THZ-300型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；JS94H型微电泳仪(Zeta电位仪)(上海中晨数字技术设备有限公司)。6、供试植物品种番茄佳粉十八(北京市农林科学院蔬菜所提供)。试验例I :那他霉素的抑菌谱测定采用抑菌圈法。供试植物病原真菌在PDA斜面上28° C恒温培养7天后，刮取其分生孢子和菌丝体置盛有无菌玻璃珠(直径2. 5mm)和无菌水的三角瓶中用力充分振荡，配成106CFU/mL的菌悬液；取200 μ L菌悬液均匀涂布在PDA平板(直径9cm)上，用直径O. 7cm的无菌不锈钢打孔器等距离打制三个孔，然后向每孔内注入100mg/L NA浓缩液lOOyL，25° C恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的直径；供试啤酒酵母菌测定方法按实施例3进行。每个处理3次重复。从表I中可以看出，除了对啤酒酵母菌的抑菌圈直径在3.00cm以下外，对其他病原真菌的抑菌圈直径均达到了 3. OOcm以上，最强的抑菌效果是对小麦纹枯病菌(R. cerealis)和李子褐腐病菌(M. fructicola),直径达4. 77cm。由此说明NA具有抑制真菌的广谱性。表I那他霉素抑菌测定结果
权利要求
1.一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊的制备方法，采用层层组装法制备，步骤如下1)将那他霉素分散于去离子水中制得悬浮液，将悬浮液超声波细化处理5-10min，获得 20-40g/L的那他霉素均匀水悬浮液A ；2)组装第一层在搅拌下向步骤I)获得的悬浮液A中加入海藻酸钠溶液、Tween-80, 氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为O.75-1. 75g/L, Tween-80的含量为7. 5-12. 5g/L，氯化钠含量为10_18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3. 5-5. 5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液Al ；3)组装第二层用3g/L乙酸配制出浓度为I.5-3. 5g/L的壳聚糖溶液，在搅拌下向步骤2)获得的悬浮液Al中加入上述壳聚糖溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，壳聚糖含量为O. 75-1. 75g/L，Tween-80的含量为2_3g/L， 氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至2. 0-4. O,反应15_20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A2 ；4)组装第三层在搅拌下向步骤3)获得的悬浮液A2中加入海藻酸钠溶液、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为I. 25-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3. 5-5. 5，反应15_20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A3 ；重复上述步骤，逐层吸附海藻酸钠和壳聚糖，直至分别得到所需包裹层数的那他霉素微胶囊，继续组装时，偶数层按照步骤3)的条件操作，奇数层按照步骤4)的条件操作，从第二层开始均使用上一步骤获得的那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液来提供那他霉素，从而进行交替组装和包覆，直至组装到需要的层数，即获得那他霉素微月父囊。
2.根据权利要求I所述的那他霉素微胶囊的制备方法，其特征在于步骤2)中海藻酸钠含量为lg/L，Tween-80的含量为10g/L，氯化钠含量为14. 6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4. 5。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中壳聚糖含量为lg/L， Tween-80的含量为2. 5g/L，氯化钠含量为14. 6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3. O。
4.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中海藻酸钠含量为2g/ L,氯化钠含量为14. 6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4. 5。
5.一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊悬浮剂，其特征在于，其中的微胶囊由权利要求1-4任一项所述的方法制备；悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分那他霉素O. 5% 5. 4% ;海藻酸钠O. 1% 3. 0% ;壳聚糖O. 1% 3. 0% ;抗沉剂O. 5% 10% ;表面活性剂O. 5% 10% ;余量为水。
6.根据权利要求5所述的那他霉素微胶囊悬浮剂，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的组分那他霉素1% 5% ;海藻酸钠O. 2% 2% ;壳聚糖O. 2% 2% ;抗沉剂1% 8% ;表面活性剂1% 5% ;余量为水。
7.根据权利要求5或6所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂还含有如下组分中的一种或多种分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂。
8.根据权利要求5或6所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述表面活性剂选自 0P-10>TX-10>Tween-20和Tween-80中的一种或多种；所述抗沉剂选自聚丙烯酸钠、娃酸镁铝和膨润土中的一种或多种。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂用于防治真菌病害。
10.根据权利要求9所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，在植物发生真菌病害之前或发病初期，按活性成分那他霉素的使用浓度25 250mg/L，优选100mg/L，将微胶囊悬浮剂兑水配制成稀释液，采用喷雾法将其喷洒于植物表面。
全文摘要
本发明公开了一种杀菌微胶囊及其悬浮剂的制备和使用方法。该微胶囊的芯材活性成分为那他霉素，以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，采用层层组装(LBL)的方法制备。该微胶囊可根据防治植物真菌病害速效性和持效性的要求调节释放速率，具有杀菌谱广、用量低、杀菌效果好、不易获得抗性等特点。
文档编号B01J13/02GK102921358SQ20121043885
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者卢向阳, 刘伟成, 杨万吉, 卢彩鸽, 吴慧玲, 董丹 申请人:北京市农林科学院