用于生物反应系统的包被的基底的制作方法
【专利摘要】提供了用于生物反应的装置。所述装置包括基底和在所述基底中的多个反应位点。所述基底的表面被配置为具有第一亲水性，且所述多个反应位点的每个表面被配置为具有第二亲水性，以用样品体积加载相当数量的反应位点。每个加载的反应位点的样品体积基本上被限制于其各自的反应位点。所述样品体积被配置为在反应位点内经历生物反应。
【专利说明】用于生物反应系统的包被的基底
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612, 005号、2012年 3月16日递交的美国临时专利申请第61/612, 087号、2012年11月7日递交的美国临时 专利申请第61/723,759号、2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612, 008号、 2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723, 658号和2012年11月7日递交的美 国临时专利申请第61/723, 738号的优先权，所有以上申请还均通过引用整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 本公开涉及处理用于生物反应系统的基底表面的方法，且更具体地，涉及对用于 生物反应系统的基底表面进行化学处理以防止生物分子粘附于该表面的方法。
[0005] 聚合酶链式反应（PCR)是扩增靶DNA序列的方法。以前，PCR通常在96或384孔 微板中进行。如果期望更高的产量，在微板中进行的常规PCR方法则不具成本效益或高效 性。而且，在增加通量方面，降低PCR反应体积可降低试剂的消耗，并从反应体积的热质减 少而使得扩增次数减少。该策略可以阵列形式（m X n)实施，产生大量的较小反应体积。此 夕卜，采用阵列允许进行具有增加的定量灵敏度、动态范围和特异性的可扩展高通量分析。
[0006] 阵列也已经被用于进行数字聚合酶链式反应（dPCR)。来自dPCR的结果可用于检 测和定量稀有等位基因的浓度，以提供核酸样品的绝对定量，并测量核酸浓度的低倍数变 化。通常，增加重复的数量能增加 dPCR结果的精确度和再现性。
[0007] 大多数定量聚合酶链式反应（qPCR)平台中的阵列形式被设计用于基于样品的分 析（sample-by-assay)的实验，其中PCR结果需为可寻址的以用于运行后分析。然而，对于 dPCR，每个PCR结果的具体位置或小井可能是不重要的，且可仅分析阳性和阴性重复的数 目。
[0008] dPCR的读数，也即，阳性反应数目和阴性反应数目与模板的浓度呈线性比例关系， 而qPCR读数（信号相对于循环）与模板浓度的对数成比例。因而，对于dPCR，可取的是使 样品体积最小化。
[0009] 然而，持续降低反应体积会导致例如对涉及将样品体积加载至阵列并维持所述样 品体积的物理分离的置信度的挑战。换句话说，将样品体积加载至尽可能多的小井或通孔 并减少小井或通孔之间的交叉串扰非常重要。
[0010] 发明概述
[0011] 在一个示例性实施方案中，提供了用于生物反应的装置。所述装置包括基底和在 所述基底中的多个反应位点。基底的表面被配置为具有第一亲水性，且所述多个反应位点 的每个表面被配置为具有第二亲水性，以用样品体积加载相当数量的反应位点。每个加载 的反应位点的样品体积基本上被限制于其各自的反应位点。所述样品体积被配置为在反应 位点内经历生物反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为根据本文教导的各种实施方案的示例性包被的基底；
[0013] 图2显示了根据本文教导的各种实施方案的后退和前进接触角；
[0014] 图3显示了根据本文教导的各种实施方案，通过样品加载器加载反应位点；
[0015] 图4的流程图显示了根据本文教导的各种实施方案的示例性方法；
[0016] 图5显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的基底表面的步骤；
[0017] 图6显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的垂直面的步骤；
[0018] 图7显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的基底表面的另一步骤；
[0019] 图8显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的垂直面的另一步骤；和
[0020] 图9的方框图显示了可使用根据本文教导的各种实施方案包被的基底的示例性 聚合酶链式反应仪。
[0021] 发明详述
[0022] 为了提供对本发明更充分的理解，以下描述列举了很多具体细节如具体结构、参 数、实例等。然而，应认识到这样的描述并非旨在限制本发明的范围，而是旨在提供对示例 性实施方案的更好描述。
[0023] 同时进行几个生物反应可能需要具有多个反应位点的基底，各反应位点具有加载 的样品。应认识到，反应位点可为但不限于，例如通孔、凹口或小井。而且，为增加每个实验 的反应数目，可增加基底上的反应位点密度，同时也降低样品区大小。例如，在15_xl5mm 的基底上可包含10, 〇〇〇个反应位点。然而，如果在15mmxl5mm的基底包含30, 000个反应 位点，样品区可随着基底上的反应位点密度不断增大而变得更小。
[0024] 根据本文描述的各种实施方案，提供了可用样品体积充分加载的装置。基底特定 区域的表面特性如疏水性和/或亲水性可有助于将液体样品加载至反应位点。如上所述， 疏水性/亲水性的水平可基于影响加载基底的多个反应位点的便利性和效率的各种因素。
[0025] 例如，影响反应位点加载的一个因素为反应位点的物理几何形状，并且/或者基 底可能有助于加载所述样品。例如基于反应位点深度（芯片厚度）和反应位点直径的反应 位点之间的纵横比，可为确定充分加载所述反应位点所需特性的因素。反应位点深度（芯 片厚度）与直径的比率被称为纵横比。例如，如果反应位点深度等于反应位点直径，则纵横 比为1。在另一实例中，当反应位点深度为反应位点直径的10倍时，纵横比为10。反应位 点的直径影响毛细管力，其使得能够/有助于用液体反应媒介加载反应位点。在一些实施 方案中，直径越小，毛细管力越大，且更利于/便于加载反应位点。
[0026] 根据各种实施方案，影响用样品体积加载反应位点的另一因素为期望的加载效率 和/或一致性。期望的效率是大于或等于90%的反应位点被加载。在其他实施方案中，期 望的效率可为90%的反应位点被加载，且反应位点之间的差异最多为10%。
[0027] 根据各种实施方案，影响用样品体积加载反应位点的另一因素为在反应位点内材 料与期望的反应的相容性。在一些实施方案中，所述期望的反应可为扩增反应。更具体地， 所述扩增反应可为聚合酶链式反应（PCR)。根据各种实施方案，装置接触例如参与反应的样 品体积、酶或试剂的部分，不应该与样品体积、酶或试剂发生化学相互作用。例如，接触反应 的材料不应该将可能干扰反应的离子泄露到所述反应位点。
[0028] 根据各种实施方案，影响加载反应位点的又一因素为被加载至反应位点后所需的 样品体积的限制。换句话说，需要有足够的力来防止从每个反应位点泄漏样品体积，以防止 从一个反应位点溢出至另一反应位点，并防止样品体积在反应位点外的任何积聚。
[0029] 考虑到上述因素，能满足这些目标的装置可被设计和用于在包含小体积的多个反 应位点中进行反应。
[0030] 为使表面产生足够的疏水/亲水特性，可将该表面包被另一种材料。根据本文教 导的各种实施方案，基底表面的部分的涂层具有亲水特性，且反应位点表面的部分的涂层 具有亲水特性。尽管两种表面均具有亲水特性，所述反应位点可通过例如毛细管作用来加 载。根据各种实施方案，所述亲水涂层可为相同的涂层。根据各种实施方案，所述涂层可通 过气相沉积来包被。
[0031] 另一方面，根据本文教导的各种实施方案，基底表面的部分的涂层具有疏水特性， 且反应位点表面的部分的涂层具有疏水特性。尽管两种表面均具有疏水特性，所述反应位 点可通过例如毛细管作用来加载。根据各种实施方案，所述疏水涂层可为相同的涂层。根 据各种实施方案，所述涂层可通过气相沉积来包被。
[0032] 而且，根据本文描述的其他实施方案，基底的包被方法包括包被基底表面的部分 以具有疏水特性，并包被基底表面的部分以具有亲水特性，这可能会有助益。而且，根据一 些实施方案，包被样品区表面以具有亲水性，并包被基底的其他表面以具有疏水性。以这种 方式，所述疏水性/亲水性有助于将液体样品加载至反应位点。所述反应位点可通过例如 毛细管作用来加载。
[0033] 此外，根据各种实施方案，具有疏水/亲水表面可减少反应位点之间液体样品的 交叉污染。所述疏水区可有助于将每个液体样品保持在反应位点内其各自的样品区。根据 各种实施方案，连续或完全的涂层也可防止或减少从基底泄漏可能会干扰反应的离子。 [0034] 根据各种实施方案，涂层相比其他涂层具有增加的物理和化学稳定性且为生物相 容的。其可防止或减少吸附以及随后用于生物反应的活性生物化学物质和材料的抑制作 用。这些可包括例如酶、探针和DNA。尤其是对于数字PCR应用，重要的是使反应化学物质 和组分被吸附至不期望的表面减至最小。
[0035] 某底
[0036] 根据本文描述的各种实施方案，基底材料可为例如硅、氧化硅、玻璃、金属、陶瓷或 塑料。玻璃可为光敏玻璃。然而，本领域技术人员应认识到，根据本文教导的各种实施方案， 可包被生物相容且不干扰荧光检测的任何材料。
[0037] 如以上所述，减少反应体积可允许更高密度的反应体积，从而可在给定的区域内 进行更多的反应。例如，基底上由300 iim直径的通孔组成的阵列可含有约30nL的反应体 积。例如，通过将阵列中每个通孔的大小降低至直径60-70 ii m，每个反应体积可为100pL。 根据本文描述的各种实施方案，反应体积的范围可为约IpL至30nL。在一些实施方案中，反 应位点阵列可由各种不同体积的反应区域组成以增加动态范围。
[0038] 图1显示了根据本文描述的各种实施方案的芯片100,其包含具有反应位点104的 阵列的基底1〇〇。芯片1〇〇可称为例如物件、装置、消耗品、阵列、滑片（slide)或压板。
[0039] 芯片100包括基底100。基底102可为各种材料，包括但不限于，例如金属、玻璃、 陶硅和氧化硅。
[0040] 芯片100还包括多个反应位点104。所述多个反应位点104可为例如小井、空腔或 通孔。每个样品区也可具有多种横截面几何形状，例如圆形、三角形或六边形。具有其他几 何形状可允许更紧密地装填反应位点，以进一步增加在给定区域中的反应数目。而且，反应 位点的几何形状也可有助于将液体样品加载至反应位点。
[0041] 图1中芯片100的横截面图显示了多个通孔104。每个通孔104从基底102第一表 面的开口延伸至基底102第二表面的开口，每个通孔104被配置为通过毛细管作用提供足 够的表面张力以容纳待处理或检测的各个含有生物样品的液体样品。芯片100可具有如以 下任一申请中所公开的通用形式或结构：美国专利第6, 306, 578、7, 332, 271、7, 604, 983、 7, 682, 565、6, 387, 331或6, 893, 877号，其通过引用整体并入本文，如同其在本文被充分地 陈述。
[0042] 根据各种实施方案，通孔104可具有约1. 3纳升的容积。可选择地，例如，通过减 小通孔104的直径和/或基底102的厚度，每个通孔的容积可小于1. 3纳升。例如，每个通 孔104具有的容积可为小于或等于1纳升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升，或小 于或等于10皮升。在其他实施方案中，一些或所有通孔104的容积范围可为1-20纳升。
[0043] 在某些实施方案中，通孔104的密度可为至少50个通孔/平方毫米。在其他实施 方案中，通孔的密度可能更高。例如，芯片100内通孔104的密度可大于或等于150个通孔 /平方毫米、大于或等于200个通孔/平方毫米、大于或等于500个通孔/平方毫米、大于或 等于1，000个通孔/平方毫米、大于或等于10, 000个通孔/平方毫米。
[0044] 芯片100的其他实施方案还描述于以下文献中：2012年3月16日递交的第 61/612, 087号临时申请（案件编号LT00655 PRO)和2012年11月7日递交的第61/723, 759 号临时申请（案件编号LT00655 PRO 2)，为所有目的将其并入本文。
[0045] 如上所述，减少样品区域的大小可导致与将液体样品加载至每个样品区有关的挑 战。根据本文描述的各种实施方案，施用至基底表面的涂层可有助于将液体样品加载至反 应位点，以及使反应位点之间的串扰减至最小。
[0046] 根据本文描述的实施方案，在包被之前，可清洁和水化所述基底以使其准备用于 随后的化学反应。清洁以去除在运输和储藏期间可能发生的任何可能的污染，例如，从而确 保包被过程的一致性。
[0047] 应认识到，本文件描述的方法和方案为根据本文描述的各种实施方案的实例。可 修改所述方案以用于高纵横比芯片和/或低纵横比芯片。在一些实施方案中，当水接触角 为60-100度时，可产生充分的加载。在其他实施方案中，当水接触角为75-90度时，可产生 充分的加载。
[0048] 而且，如各种实施方案所描述，双涂层和单涂层均可实现包被。而且，根据各种实 施方案的包被方法可包括例如液体包被方法以及气相沉积方法。
[0049] 亲水性方法
[0050] 如以上所述，根据本文教导的各种实施方案，可使用基底表面以及反应位点表面 的亲水涂层以便制备用于生物反应的反应位点阵列。同样，如以上所述，基底可称为芯片， 而反应位点可为，但不限于，例如通孔、凹口或小井。根据各种实施方案，基底表面和反应位 点的涂层可为相同的材料。在其他实施方案中，基底表面和反应位点的涂层可为不同的材 料。基底表面和反应位点表面可通过气相沉积方法来包被。
[0051] 尽管根据各种实施方案，基底表面和反应位点表面均可能具有亲水特性，可基于 毛细管作用来加载液体样品。换句话说，液体样品和反应位点壁之间的粘附力将把所述液 体样品拉入反应位点。从以下等式中可知，可被拉入每个反应位点的液体样品的量，取决于 反应位点的半径。
[0052] 液柱的高度h通过下式给出：
[0053]
【权利要求】
1. 用于生物反应的装置，所述装置包括： 基底；和 在所述基底中的多个反应位点， 其中所述基底的表面被配置为具有第一亲水性，且所述多个反应位点的每个表面被配 置为具有第二亲水性，以用样品体积加载相当数量的反应位点， 其中每个加载的反应位点的样品体积基本上被限制于其各自的反应位点，和 其中所述样品体积被配置为在反应位点内经历生物反应。
2. 如权利要求1所述的装置，其中所述第一亲水性产生60-100度的水前进接触角。
3. 如权利要求1所述的装置，其中所述第一亲水性产生75-90度的前进接触角。
4. 如权利要求1所述的装置，其中所述第一亲水性与所述第二亲水性相同。
5. 如权利要求2所述的装置，其中水后退接触角为60-100度。
6. 如权利要求5所述的装置，其中所述水前进接触角和所述后退接触角之间的差异为 〇度。
7. 如权利要求5所述的装置，其中所述水前进接触角和所述后退接触角之间的差异为 〇-30 度。
8. 如权利要求5所述的装置，其中所述水前进接触角和所述后退接触角之间的差异为 10-15 度。
9. 如权利要求1所述的装置，其中通过用相同的材料包被所述基底的表面和所述多个 反应位点的每个表面，所述基底的表面被配置为具有第一亲水性，且所述多个反应位点的 每个表面被配置为具有第二亲水性。
10. 如权利要求9所述的装置，其中所述材料为六甲基二硅氮烷（HMDS)。
11. 如权利要求9所述的装置，其中通过气相沉积方法来包被所述基底的表面和所述 多个反应位点的每个表面。
12. 如权利要求1所述的装置，其中所述相当数量的反应位点为90% -100%的所述多 个反应位点。
13. 如权利要求1所述的装置，其中加载至所述多个反应位点的液体样品体积最多为1 纳升。
14. 如权利要求1所述的装置，其中所述基底由下述材料之一组成：硅、氧化硅、玻璃和 塑料。
15. 如权利要求1所述的装置，其中所述多个反应位点为通孔。
16. 如权利要求1所述的装置，其中所述生物反应为扩增反应。
17. 如权利要求1所述的装置，其中所述第一和第二亲水性产生足够的表面张力以将 样品体积基本上限制在每个加载的反应位点内。
18. 如权利要求1所述的装置，其中毛细管作用决定加载至每个反应位点的液体样品 的体积，其中毛细管作用的量是基于每个反应位点的容积。
19. 设计具有多个反应位点的基底的方法，所述方法包括： 用第一材料确定液体样品的水前进接触角； 用所述第一材料确定液体样品的水后退接触角；以及 如果所述水后退接触角在所述水前进接触角的15度以内，则用所述第一材料包被基 底的第一表面和所述多个反应位点的每个反应位点表面。
【文档编号】B01L3/00GK104334273SQ201380023031
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月16日
【发明者】艾里奥道·陈丘, 埃文·福斯特, 西奥多·斯特劳博, 迈克尔·C·帕拉斯 申请人:生命技术公司