一种过氧化物模拟酶、制备及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种过氧化物模拟酶、制备及其应用。涉及一种辣根过氧化物酶仿生模拟技术，即在批量生产的氮化碳纳米片表面以轴向配位方式有序固定天然酶辅基-卟啉分子，生成逼近天然酶蛋白质结构的仿真酶。所得模拟酶的各项催化动力学指标与天然酶相当。在此基础上，设计了泛用性过氧化物模拟酶CoII-Hemin@g-C3N4纳米生物探针，并构建了高灵敏、高特异性检测H7N9禽流感病毒基因的生物传感器，其电致化学发光输出信号稳定，检测下限低。该模拟酶可应用于生物医学、临床诊断、环境监测、司法鉴定等方面。
【专利说明】一种过氧化物模拟酶、制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物电分析化学领域，具体涉及一种过氧化物模拟酶、制备及其应用。【背景技术】
[0002]过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，能催化很多反应。它是以H2O2为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化氧化酚类和胺类化合物与过氧化氢的反应，同时具有消除过氧化氢、酚类、胺类毒性的双重作用。过氧化物模拟酶通过人工合成的有机/无机复合物质来模拟过氧化物酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。研究模拟酶主要是为了解决酶作为一类有催化活性的蛋白质，容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，不能广泛取代工业催化剂的缺点。
[0003]现有的过氧化物模拟酶一般直接由铁卟啉及其衍生物制备，并模拟其生物活性。如Wi I Iner课题组发现的血红素核酸适配体序列，文献1: (Angew.Chem.1nt.Ed.2011, 50, 11710-11714)，其能与血红素单体特异性缔合成G四分体构型的类蛋白“DNA酶”(DNAzyme)。Huang研究团队设计的石墨烯支撑血红素的纳米复合结构的，文献2:(Angew.Chem.1nt.Ed.2012, 124，3888-3891)，其单位催化活性与辣根过氧化物酶相当。上述方法存在以下缺陷:
[0004](I)核酸价格昂贵，结构不够稳定储存条件苛刻，不适用于大规模工业合成，且催化活性依旧难于蛋白酶比肩，如文献I。
[0005](2)石墨烯造价不菲，生物功能化困难且石墨烯生产时易造成污染制约了其批量生产和应用，如文献2。
[0006](3)更为严重的是，在这些模拟酶制备中习惯以简单化学吸附方式固定卟啉辅基，构筑对应模拟酶的另一个关键因素一直被忽视，即深嵌在天然酶亚基间的血红素基团是与邻近肽链的组氨酸末端残基轴向配位的！如维生素B12的构象就是单磷酸腺苷接枝组氨酸末端轴向配位的咕啉(柯啉环)，鉴于“构效关系”法则，合成生物学和生物物理学实验已经证实轴向配位对酶的催化活性有着根本的影响！
[0007]上述缺陷造成至今为止，应用现有工艺方法难以得到性质稳定，价格低廉，结构接近天然酶，绿色环保且和天然酶催化活性相当的过氧化物模拟酶，限制其在生物分析领域的进一步应用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是制备一种简易，廉价，结构和催化活性接近天然酶，性质稳定的过氧化物模拟酶，并应用这种过氧化物模拟酶催化焦性没食子酸氧化反应及检测病毒基因。
[0009]实现本发明目的的技术解决方案为:
[0010]一种过氧化物模拟酶，以氮化碳纳米片层为载体，通过氮化碳纳米片重复性结构单元中的吡啶氮与卟啉中心钴离子的轴向配位，结合成过氧化物模拟酶。[0011]所述过氧化物模拟酶具有以下结构:
[0012]
【权利要求】
1.一种过氧化物模拟酶，其特征是:以氮化碳纳米片层为载体，通过氮化碳纳米片重复性结构单元中的吡啶氮与卟啉中心钴离子的轴向配位，结合成过氧化物模拟酶。
2.根据权利要求1所述的过氧化物模拟酶，其特征是:所述过氧化物模拟酶具有以下结构:
3.—种过氧化物模拟酶的制备方法，其特征是所述方法包括: (1)选用三聚氰胺作为反应物在马弗炉中程序升温，生成b-C3N4，再在氧气氛围下热氧化、超声生成g_C3N4 ； (2)取g-C3N4水溶液和钴卟啉的甲醇溶液混合恒温振荡，离心弃去上清液，沉降颗粒真空干燥得过氧化物模拟酶。
4.根据权利要求3所述过氧化物模拟酶的制备方法，其特征是:步骤(1)中所述的程序升温是指每分钟升温3~5°C升温至500°C ;热氧化温度为500~600°C。
5.根据权利要求3所述过氧化物模拟酶的制备方法，其特征是:步骤(1)中所述的热氧化时间为2~4h，超声时间30-60min。
6.根据权利要求3所述过氧化物模拟酶的制备方法，其特征是:步骤(2)中所述的钴卟啉选用原卟啉钴，lmg/mlg-C3N4水溶液和ImM钴卟啉的甲醇溶液混合体积比为3:1。
7.根据权利要求3所述过氧化物模拟酶的制备方法，其特征是:步骤(2)中所述的恒温振荡温度为20~25°C，恒温振荡时间为12~16h。
8.—种如权利要求1所述的过氧化物模拟酶的应用，其特征是:所述过氧化物模拟酶用于催化焦性没食子酸氧化反应。
9.一种如权利要求1所述的过氧化物模拟酶的应用，其特征是:所述过氧化物模拟酶可作为生物感应元件检测病毒基因。
10.根据权利要求9所述的过氧化物模拟酶的应用，其特征是:检测病毒基因的过程如下: (1)将玻碳电极表面进行抛光处理； (2)以希夫碱反应将末端生物素化的捕获探针DNA固定在CdTe量子点电极表面，封闭非特性吸附位点，得到核酸生物传感器；(3)将一定浓度的靶DNA与步骤2所得核酸传感器温育杂交，链霉亲和素功能化的过氧化物模拟酶滴加在电极表面，温育淋洗后，采用电致化学发光法，检测电极对靶DNA的电致化学发光 响应。
【文档编号】B01J31/22GK104014370SQ201410241361
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】邓盛元, 袁培新, 季旭波, 单丹, 黄清怡 申请人:南京理工大学