一种模拟酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及模拟酶的制备方法及其应用，具体地，涉及过氧化物模拟酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]天然酶在温和的条件下具有专一性和高效性，因此，在众多领域被广泛的研究和应用[参见 ACS Appl.Mater.1nterfaces.,2014，6，19207-19216]。然而，天然酶易因环境的改变而变性失活、价格昂贵、提纯困难且耗时比较长，给使用带来了不便[参见Catal.Sc1.Technol.，2013, 3，2761-2768]。因此，研究人员开始寻找或制备出既具有天然酶的催化性能又简单稳定的物质以实现对酶功能的模拟。所以，开发出既具有高效的催化活性，又能克服天然酶的缺点的模拟酶去代替天然酶是一项具有挑战性的工作。尤其是开发过氧化物模拟酶，它同过氧化物酶一样能够催化过氧化物氧化其它物质，特别是对过氧化氢(H202)具有高效的催化作用。而过氧化反应参与多种重要疾病的发病机制，会引起生物细胞、组织乃至器官损伤。过氧化氢(H202)作为生物反应过程中的一种重要中间物质，对其含量进行准确测定，在分析化学及临床医药中具有重大意义。
[0003]随着纳米技术的出现，以纳米材料为基础的过氧化物酶的模拟物，尤其是基于片层结构的纳米材料的过氧化物模拟酶在比色法检测中已经成为新一类的理想而又重要的工具。这类过氧化物模拟酶具有比天然酶更显著的优势，比如过氧化物模拟酶具有比较高的稳定性、制备成本低、易储存、在组成和结构设计上的灵活性等等。2011年，Guo等[参见ACS Nan0.，2011，5，1282 - 1290]制备出用Hemin功能化的石墨烯纳米片，该复合材料具有过氧化物酶的催化活性，能够可视化检测过氧化氢，进而间接用于单核苷酸多态性的检测。然而，石墨烯的价格是比较昂贵的，这就限制了该材料的应用。2013年，Zhang等[参见Sen.and Act.B.，2014，192，150 - 156]将 Hemin 固定到 Fe - Ni 双氢氧化物(Fe - Ni LDH)的插层中，制备出过氧化物模拟酶，并用于过氧化氢的定量检测。2014年，Li等[参见RSCAdv.，2014，4，24256-24262]为了提高二硫化钼的类过氧化物酶的活性，将Hemin与超声剥离后的二硫化钼混合，制备出Hemin修饰的二硫化钼复合材料作为过氧化物模拟酶。但是，以上方法检测的线性范围都非常窄，仅仅只有一个数量级，很难满足实际检测需要。
【发明内容】
[0004]本发明的主旨就是提供一种具有高催化活性的纳米材料并用于过氧化氢在较宽范围内的可视化检测的模拟酶的制备方法
[0005]为了实现上述目的，本发明提供了一种基于Hemin/Co304-NSs 二维纳米复合材料模拟酶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤:
[0006]a)将表面活性剂加入到水醇溶剂中，搅拌15-60分钟；再加入四水合醋酸钴和六次甲基四铵继续搅拌15-60分钟；再加入醇溶剂，搅拌30-60分钟，陈化0.5-2天；得到的前驱体溶液；
[0007]四水合醋酸钴、表面活性剂、六次甲基四胺、水醇溶剂、醇溶剂的重量比为1:(1-5):(0.1-1): (50-150):(50-150)；
[0008]水醇溶剂中，水与醇的体积比1: (10-15);
[0009]b)将陈化好的前驱体溶液转移到反应釜中，在100-200°C下反应l_5h，离心洗涤3-6次，将洗净的溶剂热产物在150-400°C下反应l_5h，冷却至室温，干燥至恒重，即得到四氧化三钴二维纳米片(Co304-NSs);
[0010]c)将氯化高铁血红素溶液加入Co304-NSs分散液中，室温下搅拌10_20h，依次用乙醇和去离子水离心洗涤3次，干燥至恒重，即可。
[0011 ] Co304-NSs分散液为将Co304-NSs溶解在水中，并用超声波分散10-30分钟；Co304-NSs与水的重量比为1:100-1000 ；
[0012]氯化高铁血红素与Co304-NSs的重量比为1: (1-5)。
[0013]所述的氯化高铁血红素溶液为将氯化高铁血红素溶解在氢氧化钠溶液中，氯化高铁血红素、氢氧化钠、水的重量比为1:1-10:1500-25000o
[0014]所述的表面活性剂为聚乙二醇接枝聚丙二醇。
[0015]所述的水醇溶剂的醇选自甲醇、乙醇、丙醇和乙二醇中的一种或多种。
[0016]所述的醇溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和乙二醇中的一种或多种。
[0017]通过上述技术方案，本发明首先利用表面活性剂-聚乙二醇接枝聚丙二醇(P123)在水醇混合溶剂中自组装的方法，以四水合醋酸钴为原料和六次甲基四铵为固化剂合成二维结构的四氧化三钴纳米片层材料Co304-NSs);然后将功能化分子-氯化高铁血红素(Hemin)与四氧化三钴纳米片层(Co304-NSs)直接进行常温下混合搅拌，通过物理吸附的作用将氯化高铁血红素(Hemin)固定到四氧化三钴纳米片层(Co304_NSs)上，从而制备出Hemin/Co304-NSs 二维纳米复合材料，即过氧化物模拟酶。
[0018]本发明与现有技术相比，具有过氧化物模拟酶的成本低、催化活性高且稳定性好，检测范围广的特点。
[0019]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0020]附图是用来提供对本发明的进一步解释，并构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0021]图1是检测1中的四氧化三钴纳米片(Co304-NSs)的扫描电镜图。
[0022]图2是检测1中的功能化的四氧化三钴(Hemin/Co304-NSS)纳米复合材料的扫描电镜图。
[0023]图3是检测2中的紫外吸收光谱图，
[0024]1为功能化分子(Hemin) ;2为功能化的四氧化三钴(Hemin/Co304_NSs)纳米复合材料；3为四氧化三钴纳米片(Co304-NSs)。
[0025]图4是检测3中循环伏安扫描图。
[0026]4为功能化的四氧化三钴(Hemin/Co304-NSs)纳米复合材料修饰电极；5为四氧化三钴纳米片(Co304-NSs)修饰电极；6为裸电极。
[0027]图5是实施例4中模拟酶对过氧化氢的紫外吸收光谱图。
[0028]7为加入Hemin/Co304_NSs纳米复合材料的体系，8为加入Hemin的体系，9为加入Co304-NSs的体系，10为不加任何催化剂的空白体系。
[0029]图6实施例5中模拟酶对不同过氧化氢浓度的响应曲线图。
【具体实施方式】
[0030]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不限制于本发明。
[0031]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，扫描电子显微镜图谱参数是通过场发射扫描电镜(S-4800，日本日立公司Hitachi)测得，紫外光谱图参数通过UV-2450型紫外分光光度计(Shimadzu，日本岛津公司)测得，电化学参数通过电化学工作站(CHI660C，上海辰华公司)测得。
[0032]聚乙二醇接枝聚丙二醇(P123)购于Sigma.Aldrich (St.Louis，USA)公司的市售品ο
[0033]四水合醋酸钴购买于北京百灵威科技有限公司的市售品。
[0034]氯化高铁血红素(Hemin)和六次甲基四胺购买于上海阿拉丁试剂公司的市售品。
[0035]实施例1
[0036]1)将0.2g的P123加入到13g乙醇和lg去离子水中搅拌15min ;在搅拌的条件下，再加入0.125g Co (Ac) 2.4H20和0.07g六次甲基四钱继续搅拌15min ;最后，加入13mL乙二醇再搅拌30min，得到的前驱体溶液并陈化1天。
[0037]2)将陈化后的前驱体溶液转移到45mL反应釜中，在170°C下反应2h，离心洗涤。将洗净的溶剂热产物在250°C下脱水2h得到四氧化三钴二维纳米片(Co304-NSs)。
[0038]3)将所制得的3mgCo304-NSs分散在lmL去离子水中，超声分散30分钟。
[0039]4)取lmg Hemin加入到12.65mL氢氧化钠(氢氧化钠:水=1:1916)溶液中，制得Hemin储备液。
[0040]5)将Hemin储备液逐滴加入到步骤3)中的Co304_NSs分散液中，室温下搅拌12h。反应结束后，依次用乙醇和去离子水离心洗涤3