一种泡沫精馏纯化方法

一种泡沫精馏纯化方法
【专利摘要】不同于传统的用于提取浓缩表面活性物质的泡沫分离法，本发明提供了一种能够提取浓缩、精馏纯化表面活性物质的泡沫精馏纯化方法。本方法大致可分为7步：1估测料液中目的组分和目的杂质的含量，2确定在目的组分耐受范围内目的组分表面活性最高的pH与温度T，3确定最高收集高度β和与之所对应的表观气速Q，4确定最低收集高度α,5定在高度α至高度β之间目的组分随高度变化的富集比和回收率，6根据1-5步所获数据并且根据产物的纯度要求设计纯化策略，对料液进行试纯化，并且根据检测结果对纯化策略再次进行微调，7根据1-6步所确定的所有生产条件进行生产。经过本方法纯化后，我们可以获得目的组分的浓缩液，得到所需纯度的产物。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分离纯化【技术领域】，尤其涉及一种提取浓缩并精馏纯化表面活性物质 的方法。 一种泡沬精馏纯化方法

【背景技术】
[0002] 泡沫分离技术的原理是通过鼓泡等手段，让溶液中能与表面活性剂通过物理、化 学的力结合在一起的物质或本身具有表面活性的物质在鼓泡的过程中被吸附，富集在气泡 表面，达到富集、提取待分离物质的目的。其分离的本质是溶液中各种组分在表面活性上的 差异。在泡沫分离的过程中，气体分布器在液相产生气泡，被分离的表面活性组分被吸附 在气泡的气液两相界面上，吸附完成后，气泡离开液相进入泡沫相，刚进入泡沫相的气泡会 携带很多液体，随气泡向上移动，好多液体就在重力的作用下流回液相，随着泡沫的升高， 持液量会逐渐降低，表面活性组分的浓度便逐渐升高，最终泡沫离开塔顶进入泡沫收集器， 经过消泡后，消泡液中目的组分的浓度与其进行泡沫分离前的料液中的浓度的比值为富集 t匕，回收后目的组分的含量与其进行泡沫分离前的料液中的含量的比值为回收率。与其它 纯化方式相比，泡沫分离法耗费小、污染少、操作简单、易于扩大生产规模，是一种在工业生 产方面有着极大优势的分离纯化方法。但是现有的泡沫分离法通常是作为一种对表面活性 物质提取回收及浓缩的方法，仅以富集比与回收率这两个指标对泡沫分离效果进型考量。 例如：中国专利（申请号 ：200410020391.X)公布了一种乳链菌肽的制备方法，泡沫分离作 为该制备方法中关键的一步只起到了提取及浓缩乳链菌肽的效果；又如：中国专利（申请 号：200810137886. 9)公布了一种泡沫分离法分离无患子皂苷的方法，泡沫分离作为关键步 骤在该方法中起到的作用是从无患子皂苷粗提液中提取无患子皂苷并将其浓缩制成浓缩 液，经真空蒸发与冷冻干燥后获得纯度为89-94%的产品，未见泡沫分离起到精馏产物的作 用。
[0003] 迄今为止，还未见与泡沫精馏纯化生产高纯度产物相关的专利，罕见泡沫分离法 在多元体系分离领域的相关文章，且未见过使用泡沫分离操作就纯化出某高纯度产物的成 功案例。


【发明内容】

[0004] 本发明目的是解决现有泡沫分离方法通常只能对表面活性物质进行提取回收及 浓缩而不能对目的组分进行真正意义上的纯化的问题，提供一种泡沫精馏纯化法，以便实 现对表面活性物质进行提取浓缩并精馏纯化，以获得高纯度目的组分。
[0005] 本申请发明人通过对泡沫分离操作的深入研究，对最基本的等量关系进行数学推 导，首先用数学的方法从理论上证明了使用泡沫分离操作精馏表面活性物质的可行性，然 后透过对公式的研究设计了一套完整的泡沫精馏纯化方法，并且以真菌疏水蛋白为实施例 验证了该方法在实践上的可行性。
[0006] 本发明的技术方案是： 一种泡沫精馏纯化法，该方法不仅能提取浓缩表面活性物质，还能对表面活性物质进 行精馏纯化、获得高纯度目的组分；该方法具体步骤包括： 对于目的组分含量为％、目的杂质含量为k的待分离溶液，按照已确定的pH、温度T及 表观气速Q，在泡沫塔高度Η下进行η次的鼓泡收集操作，最终得到含有所需纯度目的组分 的浓缩液。
[0007] 本发明方法中上述各生产条件及参数的具体确定过程如下： 1) 估测目的组分在待分离溶液中的含量％与目的杂质在待分离溶液中的含量k; 2) 确定在目的组分的耐受范围内目的组分表面活性最高的并且可以控制的pH与温度 T，该pH与温度T即为泡沫分离时的pH与温度条件； 3) 在步骤2)所确定的pH与温度条件下，用目的组分模拟溶液进行鼓泡操作；调节表 观气速使目的组分模拟溶液形成的泡沫柱高度不超过设备所能提供的最大高度；记录泡沫 柱能达到的最大高度β，和与此高度相对应的表观气速Q，分别记作最高收集高度β和表 观气速Q ; 4) 在步骤2)确定的pH与温度条件下，和步骤3)所确定的表观气速Q下，用目的杂质 模拟溶液进行鼓泡操作；记录下与表观气速Q相对应的泡沫柱高度α，记作最低收集高度 α ; 5) 然后在α到β这段高度区间内，在步骤2)所确定的pH与温度条件下和步骤3)所 确定的表观气速Q下使用目的组分模拟溶液或待分离溶液进行不同收集高度下的泡沫分 离操作，测定在α到β这段高度区间内不同收集高度Η下目的组分的回收率X和富集比 Υ ; 6) 根据步骤1)至步骤5)步所获数据和生产条件，根据对产品的纯度Ρ的要求进行 纯化策略分析，为了达到纯度要求，我们需要对待分离溶液进行η次的纯化，第η次纯化后 目的组分的纯度为：P^l-bcAYdY；^.....*Yn*aQ+bQ)，η为正整数，Y n为第η次纯化时目 的组分的富集比，该公式的成立条件是：在泡沫纯化过程中收集到的消泡液中只有目的组 分富集了而目的杂质没有富集；另外，我们给出第η次纯化后目的组分的总回收率为：Χ@ =Χι*Χ2*.....*χη，η为正整数,Χη为第η次纯化时目的组分的回收率；由于目的组分的浓度 对泡沫分离后表面活性物质的富集比和回收率会造成一定影响，所以为保证在步骤5)中测 定的α到β这段高度区间内不同收集高度Η下目的组分的回收率X和富集比Υ的数值结 果更有参考价值，在反复纯化时应当保证目的组分的浓度不变，所以在对待分离溶液进行 纯化时应按照如下方法操作：在进行第一次泡沫纯化时，取体积为Κ的待分离溶液在相应 的分离条件下在处理量为％的泡沫塔中进行第一次泡沫纯化，收集到的消泡液的体积记作 '，相应的，第η次纯化后获得的消泡液的体积我们记作V n，从第二次纯化开始，都要在进行 第n+1次纯化前取体积为Vn/Xn的第η次的泡沫纯化的消泡液并向其中加入溶剂至体积为 V。，并用此稀释好的体积为％的溶液进行第η+1次的泡沫纯化操作；由于我们已经在步骤 5)中测定了在浓度为％，体积为％时，在α到β这段高度区间内不同收集高度下目的组 分的回收率X和富集比Υ，所以我们获得了若干组Η-Χ-Υ的数值，在每一次泡沫纯化过程中 我们使用的泡沫柱高度可以相同也可以不同，所以我们可以向上述的纯度计算方程和回收 率计算方程中带入我们在步骤4)中获得的任意组Χ-Υ数值，计算出在令产品的纯度达到要 求的情况下回收率最高的Χ-Υ数值组，进而推算出要用多高的收集高度和纯化几次；至此， 我们便构建好了纯化策略(包括pH，温度T，柱高H，表观气速Q，纯化次数n)，下一步需要根 据此纯化策略进行试纯化，根据试纯化后产物的目的组分纯度分析结果再对纯化策略进行 微调，包括增加或减少纯化次数，改变某次或某几次纯化时的柱高以使纯度达到要求。
[0008] 7)利用原液按照步骤6)最终确定的纯化策略进行生产。
[0009] 进一步地，本发明方法对泡沫分离塔的结构、型号、类型、含不含有内部构件等均 没有限制，只要能用来顺利完成步骤1)至6)的操作步骤即可。
[0010] 进一步地，本方法为更具代表性在描述中使用的操作方式是工业生产中常用的半 批式操作方式；连续操作方式、半连续操作方式与批式操作方式也可套用本方法；连续操 作方式回收率较低，对不在意回收率而特别在意效率时可以考虑选用连续操作方式；半连 续操作方式与批式操作方式也可套用此法，但是在工业生产中意义不大，很少运用。
[0011] 进一步地，本方法的适用范围是：用本方法所纯化的目的组分应当是表面活性物 质；除目的组分外，待分离溶液中不应当含有大量的在已确定的pH与温度条件下进行泡沫 分离操作后富集比比目的组分还高的且必须除去的杂质，该类杂质应当在其它的纯化步骤 中除去。
[0012] 所述待分离溶液为含有目的组分的溶液，目的组分应当具有表面活性，溶剂本身 不应具有表面活性，溶液中也不应含有消泡成分否则影响泡沫纯化操作。
[0013] 所述目的组分为我们需要回收及纯化的表面活性物质，可以是一种或多种物质。
[0014] 所述目的杂质为在泡沫分离过程中需要除去的杂质，不一定是除目的组分以外的 所有物质。
[0015] 在步骤2)中所述的泡沫分离时的pH与温度条件应当是在目的组分的耐受范围内 选择的，并且应当是在工业生产过程中便于控制的；通常情况下我们需要控制pH与温度两 个条件，根据纯化过程的具体需求我们也可以增加或减少一些可控条件。
[0016] 在步骤3)中所述的目的组分模拟溶液为用纯净的目的组分配置的与待分离液中 的目的组分含量与成分相同或相似且不含有目的杂质且其它条件与待分离溶液相同或相 似的溶液。在步骤3)中所述的最高收集高度β为在步骤2)确定的pH与温度条件下，使 用目的组分模拟溶液进行鼓泡操作，调节表观气速使目的组分模拟溶液形成的泡沫柱高度 不超过设备所提供的最1?收集1?度，此时的泡沫柱1?度则为最1?收集1?度β。所述的表观 气速Q为在步骤2)确定的pH与温度条件下，使用目的组分模拟溶液进行鼓泡操作；调节表 观气速使目的组分模拟溶液形成的泡沫柱高度不超过设备所提供的最大高度，此时的表观 气速即为表观气速Q，与最高收集高度β相对应。
[0017] 进一步地，在步骤4)中所述的目的杂质模拟溶液应当是不含目的组分且目的杂质 与待分尚溶液中目的杂质含量与成分相同或类似且其它条件与待分尚溶液相同或类似的 溶液。
[0018] 进一步地，在步骤6)中所述的纯度计算公式4=1-13(/(YfY#.....为 目的杂质不富集即目的杂质的富集比为1时的特解，在泡沫精馏纯化方法中控制了很多条 件以便使目的杂质的富集比为1，但若这样在实际的纯化过程中还不能使目的杂志的富集 比为1或接近1则在步骤5)中需要在步骤2)所确定的pH与温度条件下和步骤3)所确定 的表观气速下用待分离溶液测量在α到β这段高度区间内不同高度Η下目的组分的回收 率X、目的组分的富集比Υ和目的杂质的富集比Υ'，并且将步骤6)中的纯度计算公式修正 为 Pn=l-bQ/ [ (Yi/Y/ ) * (Y2/Y2'）*. . . * (Yn/Yn'）*aQ+bQ]，（Yn 为第 η 次纯化时目的组分的富 集比，Υη'为第η次纯化时目的杂质的富集比）；步骤6)中的目的组分总回收率计算公式：Χ e =Χι*Χ2*χ3*......*Χη与目的杂质的富集比无关，不用修正；对于本发明所属【技术领域】的技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为 属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明方法的核心是利用不同物质在泡沫分离过程中拥有不同的富集比这一特 性来达到对不同物质的分离效果，以反复多次的"泡沫分离一稀释"操作和扩大目的组分 与目的杂质间的富集比差异为手段扩大分离效果以达到精馏目的组分的目的。
[0020] 本方法在步骤5)中测定在α到β这段高度区间内不同高度Η下目的组分的回 收率X和富集比Υ时，使用目的组分模拟溶液为材料进行测量时由于某些物质在混合物中 的含量不易检测而提出的折中手段，如果待分离液中目的组分的含量便于检测，应当用待 分离液代替目的组分模拟溶液。
[0021] 进一步地，本方法为更具代表性使用的是简单泡沫塔，对富集比的控制是通过控 制泡沫的滞空时间即表观气速不变的情况下控制泡沫收集的高度来实现的，而在保持收集 高度不变的情况下通过控制表观气速来控制泡沫的滞空时间进而控制富集比的操作方法 与本发明核心内容相同，也应当视为属于本发明的保护范围；而其它类型的泡沫塔或其它 操作方式控制富集比的方式不一定是控制收集泡沫的滞空时间，可能是其它方式，但无论 通过何种方式控制富集比，在不脱离本发明构思的前提下，都应当视为属于本发明的保护 范围。
[0022] 本方法在需要进行反复多次的纯化操作时，适用于本方法的消泡方式不应当影响 下一次的鼓泡。
[0023] 进一步地，本方法在步骤6)中进行稀释操作时所用的溶剂应当具有无表面活性、 能够溶解目的组分、不产生有害化学反应等特点，技术人员可根据具体需求进行选择。
[0024] 进一步地，本方法的适用范围包括真菌疏水蛋白。
[0025] 本发明的理论依据及推到过程： 由于在实际生产过程中，要纯化的产物有时不止一种，要去除的杂质往往也不止一种， 所以为了方便，我们把要纯化的物质统称为目的组分，把要去除的杂质统称为目的杂质，根 据泡沫分离过程中的最基本概念与现象，对目的组分的纯度进行数学公式推导： 设：目的组分在初始待分离液中的浓度为ay 目的杂质在初始待分离液中的浓度为tv 第η次泡沫分离过程造成的目的组分的富集比为Υη(η为正整数）， 第η次泡沫分离过程造成的目的杂志的富集比为Υη'（η为正整数）， 目的组分在第η次泡沫分离过程中的回收率为Χη (η为正整数)， 目的组分在第η次泡沫分离过程后的纯度为Ρη (η为正整数)， 根据最基本的概念，目的组分的纯度Ρ=目的组分浓度八目的组分浓度+目的杂质浓 度）。
[0026] 在初始待分离液经过一次泡沫分离后：收集到的破沫液体积为VI，目的组分的浓 度为，目的杂质的浓度为。第一次泡沫分离后目的组分纯度为： PeaA/^Yi+bdY/ M-b'Y/ /(aA+b'Y/ M-bo/KY^Y/
[0027] -次泡沫分离操作通常无法使纯度P接近1，所以为了达到精馏目的组分的目的， 通常需要进行多次泡沫分离操作。
[0028] 在第二次泡沫分离过程前：将第一次泡沫分离的收集液稀释或浓缩至体积V/，则 此时目的组分浓度为adYfV/V/，目的杂质的浓度为b'Y/ M/V/。
[0029] 在经过第二次泡沫分离后：收集到的破沫液体积为V2，目的组分浓度为 ac^YfVfY/V/ ,目的杂质的浓度为。第二次泡沫分离后目的组分的纯度 为： ^(ao^Y^V^VV/ )/[(a0*Y1*V1*Y2/V1, ) + ΜΥ/ /V/ )]= l-b〇/[(VYi，)*(VY2, )*a0+b0]〇
[0030] 在第三次泡沫分离过程前：将第二次泡沫分离的收集液稀释或浓缩至体积v2'，则 此时目的组分浓度为（adYfViAW) / (V/ *V2'），目的杂志的浓度为（b。％' *V#Y2' *V2) 取，*v )。
[0031] 在经过第三次泡沫分离后：收集到的破沫液体积为％，目的组分浓度为 (a(i* Yi*Vi*Y2*V2*Y3V( Vi' *V2'），目的杂志的浓度为（b(i*Yi' *Vi*Y2' *V2*Y3' V(Vi' *V2'）。第 三次泡沫分离后目的组分的纯度为： P3=[ (a0*Y1*V1*Y2*V2*Y3) / (￥/*￥/)]/[ (a0*Y1*V1*Y2*V2*Y3) / (￥/*￥/) + (VY，拷凡，*V2*Y3，）取，*V )]= l-VTa/Y，）*(Y2/V )*(Y3/V )*a0+b0]。
[0032] 依此类推，第n次泡沫分离后，目的组分的纯度计算公式为： Pn=l-bQ/ [ (Yi/Y/ ) * (Y2/V ) *. . . * (Yn/Yn'）*aQ+bQ]。（η 为正整数）另外，根据回收率的 概念，给出第η次泡沫分离后目的组分的总回收率计算公式：Χ总=Χ#Χ2*Χ3*......*X n。 根据数学推导，发明人推导出目的组分在多次纯化中的纯度计算公式 Υ/ )*(Υ2/Υ2'）*. ..*(Yn/Yn' hafbj，由此我们可见，最终目的组分的纯度与每次纯化时 对料液稀释或浓缩的倍数没有关系，只与初始待分离液中的目的组分与目的杂质的浓度 和每次泡沫分离操作中目的组分与目的杂质的富集比有关。由于ayk为定值，所以（Y/ Y/ )*(Y2/Y2'. . *(Yn/Yn'）的值越高，获得的目的组分纯度也就越高。以往的泡沫分 离操作少见多级操作，即便有，以前的多级泡沫分离操作也是将泡沫分离后所获得的浓缩 液继续进行泡沫分离继续浓缩提高目的组分富集比的操作，将泡沫分离后所获得的浓缩 液稀释后再浓缩这样的多级泡沫分离操作是没有出现过的。在泡沫分离过程中，产物的 富集比是会随着产物浓度的升高而下降的，所以在没有稀释操作的多级泡沫分离过程中， 每次泡沫分离操作的富集比会随着目的组分的浓度越来越高而降低，最终（t/Y/ )*(Υ2/ Υ2'）*...*(Υη/Υη'）的值也就在几十这个数量级上，所获目的组分大多为粗品。而在有稀释 操作的多级泡沫分离过程中，目的组分的浓度由于每次的稀释，浓度上基本上保持稳定，每 次的富集比也保持稳定，因此（Yi/Y/ )*(Υ2/Υ2'. *(Υη/Υη'）的值是随着泡沫分离次数 的增加呈指数型增长的，即便每次泡沫分离时目的组分的富集比与目的杂质的富集比的比 值只有5,在经过7次泡沫分离操作后（Yi/Y/MW)*.. . *(Υη/Υη'）的值就达到了惊人 的78125,这是没有稀释操作的多级泡沫分离过程所不能达到的，而非常高的（Yi/Y/Mt/ Y2'）*...*(Yn/Yn'）的值就意味着我们获得了纯度非常高的目的组分。为了获得更高的（Y/ Υ/ )*(Υ2/Υ2'）*...*(Υη/Υη'）的值，多次的"泡沫分离--稀释"操作是一方面，另一方面 则是提高（Yn/Yn'）的值，由此我们才会设立一系列的泡沫分离条件来尽量提高目的组分的 富集比，压低目的杂质的富集比。
[0033] 在实际操作的过程中，目的杂质往往成分非常复杂，富集比很难测量，所以本发明 才设立了一系列方法促使目的杂质的富集比降到最低，所以在一般条件下为了方便构建纯 化策略只测量目的组分的富集比，而目的杂质默认为在我们的条件控制下没有富集即富集 比为1，从而获得简化的纯度计算公式.....★Yjad+bd),而为了修正目的 杂质的富集比不为1和实验中所需数据测量的误差所造成的影响需要在对试纯化的结果 进行检测后根据检测结果再考虑对已构建的纯化策略进行微调，包括增加或减少纯化次数 或增大减少稀释倍数等。只有在实在控制不住目的杂质的富集，实际的纯化结果与我们预 测的结果相差非常大时，才有必要去测量目的杂质的富集比，进而对公式进行修正。
[0034] 在实际生产过程中不仅需要考虑产物纯度，还要尽量提高回收率，而富集比的提 高往往伴随着回收率的下降，所以在本方法中需要测量从α到β这段高度区间内不同的 泡沫收集高度下目的组分的回收率和富集比，以便用所获数值带入纯度及回收率计算公式 计算另产物纯度达到要求的情况下回收率最高的方案。 由此可见，本发明破除了传统的思路，总结了泡沫分离方向上的研究成果，大胆的进行 了猜想和创新，以数学先行的实验方式充分开发了泡沫分离操作的潜力，构建了一种不仅 能提取浓缩表面活性物质，还能对表面活性物质进行精馏纯化、获得高纯度的目的组分的 泡沫精馏纯化方法，其核心是利用不同物质在泡沫分离过程中拥有不同的富集比这一特性 来达到对不同物质的分离效果，以反复多次的"泡沫分离--稀释"操作和扩大目的组分与 目的杂质间的富集比为手段扩大富集比的差异造成的分离效果以达到精馏目的组分的目 的。
[0035] 本发明针对当前泡沫分离法的不足，充分发挥了泡沫分离法在精馏纯化目的组分 上的潜力，构建了一种不仅能提取浓缩表面活性物质，还能对表面活性物质进行精馏纯化、 获得高纯度目的组分的泡沫精馏纯化方法。
[0036] 本发明的优点和有益效果： 本发明的主要特点是不仅发挥了泡沫分离法在提取、富集表面活性物质上的作用，还 充分开发了泡沫分离法在精馏纯化目的组分上面的潜力，核心是利用不同物质在泡沫分离 过程中拥有不同的富集比这一特性来达到对不同物质的分离效果，以反复多次的"泡沫分 离--稀释"操作和扩大目的组分与目的杂质间的富集比为手段扩大富集比的差异造成的 分离效果以达到精馏目的组分的目的。为表面活性物质的纯化提出了一个成本低、污染小、 易操作、效果好、易于扩大规模的纯化方式。
[0037]

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1是纯化产物SDS-PAGE检测图，M :marker，1 :纯化后样品，2 :western blot杂 交结果。
[0039] 图2是HGF I发酵上清液液SDS-PAGE检测图，M :marker，1 :HGF I发酵上清液。
[0040]

【具体实施方式】
[0041] 实施例1、用于从发酵上清液中纯化真菌疏水蛋白HGF I 1估测HGF I和杂蛋白在发酵上清液中的含量； 发酵上清液中主要是离子等小分子物质和蛋白质，由于超滤法在去除离子上有优势， 所以在泡沫分离过程中我们不把离子等小分子物质当作杂质，而只把杂蛋白当作杂质，即 HGF I为前文所述的目的组分，杂蛋白为目的杂质。通过对发酵上清液进行sds-page电泳 如图2 (M :marker，l :HGF I发酵液)，并对凝胶进行灰度分析，我们得到的结果是HGF I约 占泳道总灰度的60%，杂蛋白约占泳道总灰度的40%。通过对发酵上清液进行BCA定量，我 们得知发酵上清液总蛋白含量为〇. 374mg/ml，由此我们估测HGF I的含量约为0. 22mg/ml， 杂蛋白含量约为〇· 15mg/ml。
[0042] 2确定在HGF I的耐受范围内令其表面活性最高的并且可以控制的pH与温度条 件。
[0043] 对蛋白质表面活性影响大的并且在发酵上清液中能够控制的条件就是pH和温 度，经过测定，在pH为3. 25,温度为30°C时HGF I的表面活性最高，且在这种条件下并不影 响蛋白质的活性。
[0044] 3确定最高收集高度β和与之所对应的表观气速Q 利用纯的HGF I蛋白配置了浓度为0. 22mg/ml的目的组分模拟溶液来模拟发酵上清液 中的HGF I，我们使用内径为4cm、外径为5cm的简单泡沫分离塔的，在pH为3. 25,温度为 30°C的条件下，调节表观气速，令泡沫柱的最大高度达到一个比较适宜的高度。最终，我们 在Q=56cm/min的表观气速下得到了高度不超过90cm的泡沫柱，即β =90cm。
[0045] 4确定最低收集高度α 我们利用空载体发酵上清液配置了总蛋白浓度为〇. 15mg/ml的目的杂质模拟溶液来 模拟发酵上清液中的杂蛋白。在pH为3. 25,温度为30°C，表观气速为56cm/min等条件 下，该蛋白液在内经4cm，外径5cm的简单泡沫塔中形成了将近25cm的稳定的泡沫柱。即 a =25cm。所以，我们计划在25cm，45cm，65cm，85cm四个不同的高度上用目的组分模拟溶液 测量相应的回收率和富集比等值。测量结果如表1 d - aig nil - t· 二.?.:i Wr 0 221 m) I 019 10 4 ￠01 /3 0?# 4>cm A 靈 P44 16 4S〇7 76 〇% I ：>3 W "S Oefi S5cm 1 ￠52 S 7 表1: ++W司高t +h目的 的回收樂与富奧比 5测定在高度a至高度β之间目的组分随高度变化的富集比和回收率 根据纯度及回收率计算公式对第4步所获得的组数据进行考量，同时兼顾纯度及回收 率两个指标，最终，我们计划在65cm的高度上对蛋白进行两次泡沫纯化来获得纯蛋白，根 据纯度公式计算所得预测的纯化后的纯度为97. 85%，回收率为60. 84%。
[0046] 6根据1-5步所获数据并且根据产物的纯度要求设计纯化策略，对料液进行试纯 化， 并且根据纯度检测结果对纯化策略再次进行微调 在1-5步所确定的所有条件下对发酵上清液进行泡沫纯化操作，从100ml发酵上清液 中收集到了 18. 9mg蛋白，产物用SDS-PAGE检测。结果如图1结果显示（M:marker，l :收集 液505^^^检测结果，2:冊8丨6111131〇丨检测结果)，在101(0和151(0上有两条明显的带，在 用HGF I抗体进行的western blot检测结果中，在10KD和15KD这两个位置上也有两个杂 交带，这是因为真菌疏水蛋白HGF I的疏水相互作用较强，易形成多聚体。由于HGF I的分 子量为8030Da，而且我们在进行SDS-PAGE检测时为了将大分子蛋白检测清晰使用了浓度 较低的10%的凝胶，所以分子量大小在10KD -下的蛋白会因为分不开而聚集在10KD的位 置上，所以单体的HGF I由于分子量较小在SDS-PAGE中的位置会比较靠上而体现在10KD 的位置上。而15KD位置上的条带由于在western blot检测中有杂交结果，所以我们根据 其分子量大小推测其为HGF I的二聚体。根据SDS-PAGE及wentern blot检测结果说明 10KD和15KD两个位置上都是HGF I。SDS-PAGE检测结果中只有15KD上方的一个浅浅的 痕迹在western blot结果中没有检测结果，说明15KD上方的那个浅带可能为杂蛋白带，也 可能为15KD位置上条带的拖影，但是其量很少，纯化结果符合要求，不必再进行调整。
[0047] 7根据在1-6步的实验中我们所确定的所有的生产条件进行生产。
[0048] 根据以上步骤我们所确定的生产条件为：在pH=3. 25,温度为30°C，表观气速为 56cm/min，柱高为65cm的条件下进行两次纯化，最终以3L HGF I发酵上清液为原料进行纯 化，从3L发酵上清液中提取出了 0. 6g蛋白。
【权利要求】
1. 一种泡沫精馏纯化方法，该方法的具体步骤包括： 对于目的组分含量为％、目的杂质含量为k的待分离溶液，按照已确定的pH、温度T及 表观气速Q，在泡沫塔高度Η下进行η次的鼓泡收集操作，最终得到含有所需纯度目的组分 的浓缩液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中各生产条件及参数的具体确定 过程如下： 1) 估测目的组分在待分离溶液中的含量％与目的杂质在待分离溶液中的含量k; 2) 确定在目的组分的耐受范围内目的组分表面活性最高的并且可以控制的pH与温度 T，该pH与温度T即为泡沫分离时的pH与温度条件； 3) 在步骤2)所确定的pH与温度条件下，用目的组分模拟溶液进行鼓泡操作；调节表 观气速使目的组分模拟溶液形成的泡沫柱高度不超过设备所能提供的最大高度；记录泡沫 柱能达到的最大高度β，和与此高度相对应的表观气速Q，分别记作最高收集高度β和表 观气速Q ; 4) 在步骤2)确定的pH与温度条件下，和步骤3)所确定的表观气速Q下，用目的杂质 模拟溶液进行鼓泡操作；记录下与表观气速Q相对应的泡沫柱高度α，记作最低收集高度 α ; 5) 然后在α到β这段高度区间内，在步骤2)所确定的pH与温度条件下和步骤3)所 确定的表观气速Q下使用目的组分模拟溶液或待分离溶液进行不同收集高度下的泡沫分 离操作，测定在α到β这段高度区间内不同收集高度Η下目的组分的回收率X和富集比 Υ ; 6) 根据步骤1)至步骤5)所获数据和生产条件，根据对产品的纯度Ρ的要求进行纯 化策略分析，为了达到纯度要求，我们需要对待分离溶液进行η次的纯化，第η次纯化后 目的组分的纯度为：P^l-bcAYdY；^.....*Yn*aQ+bQ)，η为正整数，Y n为第η次纯化时目 的组分的富集比，该公式的成立条件是：在泡沫纯化过程中收集到的消泡液中只有目的组 分富集了而目的杂质没有富集；另外，我们给出第η次纯化后目的组分的总回收率为：Χ@ =Χι*Χ2*.....*χη，η为正整数,Χη为第η次纯化时目的组分的回收率；由于目的组分的浓度 对泡沫分离后表面活性物质的富集比和回收率会造成一定影响，所以为保证在步骤5)中测 定的α到β这段高度区间内不同收集高度Η下目的组分的回收率X和富集比Υ的数值结 果更有参考价值，在反复纯化时应当保证目的组分的浓度不变，所以在对待分离溶液进行 纯化时应按照如下方法操作：在进行第一次泡沫纯化时，取体积为Κ的待分离溶液在相应 的分离条件下在处理量为％的泡沫塔中进行第一次泡沫纯化，收集到的消泡液的体积记作 '，相应的，第η次纯化后获得的消泡液的体积我们记作V n，从第二次纯化开始，都要在进行 第n+1次纯化前取体积为Vn/Xn的第η次的泡沫纯化的消泡液并向其中加入溶剂至体积为 V。，并用此稀释好的体积为％的溶液进行第η+1次的泡沫纯化操作；由于我们已经在步骤 5)中测定了在浓度为％，体积为％时，在α到β这段高度区间内不同收集高度下目的组 分的回收率X和富集比Υ，所以我们获得了若干组Η-Χ-Υ的数值，在每一次泡沫纯化过程中 我们使用的泡沫柱高度可以相同也可以不同，所以我们可以向上述的纯度计算方程和回收 率计算方程中带入我们在步骤4)中获得的任意组Χ-Υ数值，计算出在令产品的纯度达到要 求的情况下回收率最高的Χ-Υ数值组，进而推算出要用多高的收集高度和纯化几次；至此， 我们便构建好了纯化策略，包括pH，温度T，柱高H，表观气速Q，纯化次数η这些条件；下一 步需要根据此纯化策略进行试纯化，根据试纯化后产物的目的组分纯度分析结果再对纯化 策略进行微调，包括增加或减少纯化次数，改变某次或某几次纯化时的柱高以使纯度达到 要求； 7)利用原液按照步骤6)最终确定的纯化策略进行生产。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法对泡沫分离塔的结构、型号、类 型、含不含有内部构件均没有限制，只要能用来顺利完成步骤1)至6)的操作步骤即可。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于本方法为更具代表性在描述中使用的 操作方式是工业生产中常用的半批式操作方式；连续操作方式、半连续操作方式与批式操 作方式也可套用本方法；连续操作方式回收率较低，对不在意回收率而特别在意效率时可 以考虑选用连续操作方式。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于本方法的适用范围是：用本方法所纯 化的目的组分应当是表面活性物质；除目的组分外，待分离溶液中不应当含有在已确定的 pH与温度条件下进行泡沫分离操作后富集比比目的组分还高的且必须除去的杂质，该类杂 质应当在其它的纯化步骤中除去；本方法的适用范围包括真菌疏水蛋白。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤3)中所述的目的组分模拟溶液为用 纯净的目的组分配置的与待分离液中的目的组分含量与成分相同或相似且不含有目的杂 质且其它条件与待分离溶液相同或相似的溶液。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤4)中所述的目的杂质模拟溶液应当 是不含目的组分且目的杂质与待分离溶液中目的杂质含量与成分相同或类似且其它条件 与待分离溶液相同或类似的溶液。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤6)中所述的纯度计算公式^"=1-1^/ (Y^Y2*……为目的杂质不富集即目的杂质的富集比为1时的特解，在泡沫精馏 纯化方法中控制了很多条件以便使目的杂质的富集比为1，但若这样在实际的纯化过程中 还不能使目的杂志的富集比为1或接近1，则在步骤5)中需要在步骤2)所确定的pH与温 度条件下和步骤3)所确定的表观气速下用待分离溶液测量在α到β这段高度区间内不 同高度Η下目的组分的回收率X、目的组分的富集比Υ和目的杂质的富集比Υ'，并且将步骤 6)中的纯度计算公式修正为 )*(Υ2/Υ2'. . *(Yn/Yn'）*aQ+bQ]，Υη 为第 η 次纯化时目的组分的富集比，Υη'为第η次纯化时目的杂质的富集比；步骤6)中的目的组 分总回收率计算公式AgzXdXdX#......*X n与目的杂质的富集比无关，不用修正。
9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于本方法为更具代表性使用的是简单泡沫 塔，对富集比的控制是通过控制泡沫的滞空时间即表观气速不变的情况下控制泡沫收集的 高度来实现的，而在保持收集高度不变的情况下通过控制表观气速来控制泡沫的滞空时间 进而控制富集比的操作方法与本发明核心内容相同，也应当视为属于本发明的保护范围。
10. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于在步骤6)中进行稀释操作时所用的溶剂 应当具有无表面活性、能够溶解目的组分、不产生有害化学反应的特点，技术人员可根据具 体需求进行选择。
【文档编号】B01D3/42GK104117220SQ201410316148
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】于勇, 乔明强, 赵立强, 邰飞飞, 王翔翔, 刘金源, 白艳玲, 张秀明, 徐海津 申请人:南开大学