一种全血预处理微流控装置及全血预处理方法

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及到一种全血预处理微流控装置及全血预处理方法。

背景技术：

血液是人体中一种特殊的结缔组织，富含丰富的营养物质和代谢产物等等，蕴含大量关于人体健康的信息，因此在疾病诊断、健康分析中血液成分的检测分析必不可少。其中检测血液中的血细胞数量和形态可以初步判断人体的健康状况、贫血与否以及抵抗力情况，是医院最常见的例行检查之一。目前对于血液中血细胞的分离提取多采用血细胞分离机，常见的血细胞分离机有离心式、滤膜式和吸附式。离心式血细胞分离机需要借助离心机，使得血液中的物质根据密度、粘度等特性的不同而分离；滤膜式分离机通过滤膜的分子筛特性主要用于患者的血浆置换，供血者的血浆、血小板采集，临床应用较为单一；吸附式分离机主要通过特质的免疫吸附柱特异性去除血浆中的某种物质。上述血细胞分离机体积庞大、价格昂贵，无法实现现场实时处理，并且通常只能够分离血液中的某一种血细胞，而不能对更多不同细胞对象同时处理。

败血症指各种致病菌进入血液，产生毒素而引发的全身感染。血液中是否含有致病菌，以及致病菌的种类、数量是诊断败血症的关键，而血液中实际的细菌含量较少，现在常用的血培养、细菌图片镜检等检查方式，对检验人员有着较高要求。同时常用传统的细菌培养技术耗时长，不能满足实时检测的要求。

肿瘤转移是影响肿瘤患者健康的最主要原因，而检测血液中的循环肿瘤细胞，可以在早期实现恶性肿瘤的诊断，对患者预后判断、疗效评价、及早治疗都有重要的指导作用。但是循环肿瘤细胞在肿瘤患者体内的含量极低，每毫升全血中仅有1-10个，为了后续有效地检测通常需要先对循环肿瘤细胞进行富集。目前常用的循环肿瘤细胞富集方式多为亲和性富集和物理过滤的方式。

血液中的成分复杂，蕴含着各种有关人体健康的信息，然而血液中成分复杂，各种不同成分的含量、体积、特性差异较大，需要采用不同的处理方式，比如对含量较低的循环肿瘤细胞和细菌等需要进行提取和富集，对于白细胞红细胞等需要不破坏地从血液中分离，以便进一步的检测。因此我们需要一种小型、便携式和集成化装置，能够有效对血液中不同的成分进行分离、富集和提取以实现后续健康诊断的预处理装置。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全血预处理微流控装置及全血预处理方法，可以将全血中的血细胞、循环肿瘤细胞、细菌以及血清快速分离，并对其中含量较低的循环肿瘤细胞、细菌等进行富集以便后续检测。

为达上述目的，本发明提供了一种全血预处理微流控装置，包括由上至下依次设置的副盖片层、主盖片层、一级处理结构、二级处理结构、三级处理结构和四级处理结构，一级处理结构包括由上至下依次设置的一级过滤物提取管道层、一级多孔过滤膜和一级过滤液导出管道层，一级过滤物提取管道层和一级过滤液导出管道层中间均设置有进样口，一级过滤物提取管道层的进样口左侧和一级过滤液导出管道层的进样口右侧设置有平行支管道，一级多孔过滤膜上均匀设置有若干通孔，主盖片层设置有若干出样口和一个主进样口。

采用上述方案的有益效果是：通过四级不同过滤膜尺寸的处理结构，可以对全血中环肿瘤细胞、白细胞红细胞、血小板和细菌进行选择性地分离、富集和提取。副盖片层上的各个粘性可撕盖片依次对应不同的出样口，通过控制粘贴和揭开，即可以控制流体的流向，从而实现不同液体和物质的分离。例如一级处理结构，包括三个层次，一级过滤物提取管道层、一级多孔过滤膜和一级过滤液导出管道层，一级多孔过滤膜上均匀设置有若干通孔一，通过进样口将全血样品注入后，其中的循环肿瘤细胞留在一级多孔过滤膜上，其他细胞和溶液则可以通过一级过滤液导出管道层右侧的平行支管道通过pe管排出，而循环肿瘤细胞则可以通过一级过滤物提取管道层左侧的平行支管道通过pe管排出，至此完成一级处理。

进一步地，二级处理结构包括由上至下依次设置的二级过滤物提取管道层、二级多孔过滤膜和二级过滤液导出管道层，二级过滤物提取管道层和二级过滤液导出管道层中间均设置有进样口，二级过滤物提取管道层的进样口左侧和二级过滤液导出管道层的进样口右侧设置有平行支管道，二级多孔过滤膜上均匀设置有若干通孔二。

进一步地，三级处理结构包括由上至下依次设置的三级过滤物提取管道层、三级多孔过滤膜和三级过滤液导出管道层，三级过滤物提取管道层和三级过滤液导出管道层中间均设置有进样口，三级过滤物提取管道层的进样口左侧和三级过滤液导出管道层的进样口右侧设置有平行支管道，三级多孔过滤膜上均匀设置有若干通孔三。

进一步地，四级处理结构包括由上至下依次设置的四级过滤物提取管道层、四级多孔过滤膜和四级过滤液导出管道层，四级过滤物提取管道层和四级过滤液导出管道层中间均设置有进样口，四级过滤物提取管道层的进样口左侧和四级过滤液导出管道层的进样口右侧设置有平行支管道，四级多孔过滤膜上均匀设置有若干通孔四。

进一步地，主盖片层、一级过滤物提取管道层、二级过滤物提取管道层、三级过滤物提取管道层、四级过滤物提取管道层、一级过滤液导出管道层、二级过滤液导出管道层、三级过滤液导出管道层和四级过滤液导出管道层的材质均为聚二甲基硅氧烷，副盖片层的材质为粘性聚二甲基硅氧烷。

采用上述方案的有益效果是：粘性聚二甲基硅氧烷可以随时撕下或重新贴合，多次使用。

进一步地，粘性聚二甲基硅氧烷通过以下方法制备得到：

(1)将聚二甲基硅氧烷预聚物主剂和配套硬化剂按照5-15:1的质量比混合；

(2)将步骤(1)所得物和体积分数为80％的乙氧基化的聚乙烯亚胺溶液按照10g：15～55ul的比例混合，搅拌均匀后抽真空，于真空度低于1mbar的真空条件下预脱气1小时，并90～100℃烘箱中加热2小时，制得。

进一步地，一级过滤物提取管道层、二级过滤物提取管道层、三级过滤物提取管道层、四级过滤物提取管道层、一级过滤液导出管道层、二级过滤液导出管道层、三级过滤液导出管道层和四级过滤液导出管道层均通过以下方法制备得到：将聚二甲基硅氧烷预聚物主剂和配套硬化剂质量比为5-15:1的比例混合，充分搅拌后抽真空，在真空度低于1mbar的真空条件下预脱气1小时，倒入带有通道结构的阳模模具中，于60～70℃烘箱中加热2小时，制得。

进一步地，一级多孔过滤膜、二级多孔过滤膜、三级多孔过滤膜和四级多孔过滤膜的材质均为聚碳酸酯，通孔一、通孔二、通孔三和通孔四的孔径分别为8～13μm、3～6μm、600nm～2μm、100～300nm。

采用全血预处理微流控装置进行全血预处理的方法，包括以下步骤：

s1：进样

在主进样口推进全血待处理样本，根据过滤物质，选择揭开主进样口右侧对应的副盖片层的粘性可撕盖片；

s2：过滤

在相应的出样口插入pe管，保持其他副盖片层的粘性可撕盖片继续贴合，过滤后的溶液从pe管流出到装置外部，分离物质保存在多孔过滤膜上；

s3：提取分离

步骤s2完成后，从主进样口通入浸润性溶液与多孔过滤膜上的分离物质混合，揭开对应级出样口左侧粘性可撕盖片，保持其他副盖片层的粘性可撕盖片继续贴合，插入pe管，将过滤膜上的分离物质提取到装置外部。

进一步地，过滤物质依次包括循环肿瘤细胞、白细胞红细胞、血小板和细菌，与过滤物质一一对应的粘性可撕盖片依次包括粘性可撕盖片五、粘性可撕盖片六、粘性可撕盖片七和粘性可撕盖片八，出样口左侧粘性可撕盖片与过滤物质从右往左一一对应，包括粘性可撕盖片一、粘性可撕盖片二、粘性可撕盖片三和粘性可撕盖片四。

综上所述，本发明具有以下优点：

1、本发明利用多孔膜的微孔分子筛特性，结合粘性聚二甲基硅氧烷，制成可撕盖片的多级全血预处理微流控装置，该装置的特点是小型集成多级过滤系统，结合多孔过滤膜的特点，将不同尺寸的血液成分分离，并结合本发明特有的流体控制方式，可以根据需要选择分离某一种或几种不同物质，为后续检测提供更好的样本；

2、采用粘性聚二甲基硅氧烷盖片进行贴合，使得最上层的出样口可以动态地选择、调整，从而有效实现装置中对流体流动的控制，避免了其他微流控装置中需要控制流体流动而外加的微型泵，微型阀和微混合器等器件，使得整个装置更加小型化；

3、可以随时切换出样口，有选择地分离或提取某一种物质，剩余样本还可以另作他用，避免传统离心式分离将样本一次性全部使用的缺点；

4、通过管道方向不同以及本发明中特殊的流体控制方式可以实现集过滤、富集、提取于一体的血液预处理操作；

5、粘性的聚二甲基硅氧烷盖片可随时撕下或重新贴合，多次使用，对于本装置中需要分离提取不同物质时可以根据需要选择，避免了其他分离装置对特定物质过滤只能由固定一整套装置实现的方式。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明去除pe管的结构示意图；

图3为顶层盖片出样口装置示意图；

图4为试验例使用800nm孔径过滤膜处理血液样本前后对比图；

其中，1、一级处理结构；2、二级处理结构；3、三级处理结构；4、四级处理结构；5、主盖片层；6、副盖片层；1-1、一级过滤物提取管道层；1-2、一级多孔过滤膜；1-3、一级过滤液导出管道层；2-1、二级过滤物提取管道层；2-2、二级多孔过滤膜；2-3、二级过滤液导出管道层；3-1、三级过滤物提取管道层；3-2、三级多孔过滤膜；3-3、三级过滤液导出管道层；4-1、四级过滤物提取管道层；4-2、四级多孔过滤膜；4-3、三级过滤液导出管道层；5-1、一级过滤物提取出样口；5-2、二级过滤物提取出样口；5-3、三级过滤物提取出样口；5-4、四级过滤物提取出样口；5-5、一级过滤液导出出样口；5-6、二级过滤液导出出样口；5-7、三级过滤液导出出样口；5-8、四级过滤液导出出样口；5-9、主进样口；6-1、粘性可撕盖片一；6-2、粘性可撕盖片二；6-3、粘性可撕盖片三；6-4、粘性可撕盖片四；6-5、粘性可撕盖片五；6-6、粘性可撕盖片六；6-7、粘性可撕盖片七；6-8、粘性可撕盖片八。

具体实施方式

本发明提供了一种全血预处理微流控装置和全血预处理方法，使用本装置可以对全血中的四种物质进行分离、富集、提取。并且可以通过控制出样口有选择地实现①只处理循环肿瘤细胞；②只处理循环肿瘤细胞和白细胞红细胞；③只处理循环肿瘤细胞、白细胞红细胞和血小板；④循环肿瘤细胞、白细胞红细胞、血小板、细菌都进行预处理。

其中装置包括由上至下依次设置的副盖片层6、主盖片层5、一级处理结构1、二级处理结构2、三级处理结构3和四级处理结构4，一级处理结构1包括由上至下依次设置的一级过滤物提取管道层1-1、一级多孔过滤膜1-2和一级过滤液导出管道层1-3，一级过滤物提取管道层1-1和一级过滤液导出管道层1-3中间均设置有进样口，一级过滤物提取管道层1-1的进样口左侧和一级过滤液导出管道层1-3的进样口右侧设置有平行支管道，一级多孔过滤膜1-2上均匀设置有若干通孔一，主盖片层5设置有若干个出样口和一个主进样口5-9。

其中，二级处理结构2包括由上至下依次设置的二级过滤物提取管道层2-1、二级多孔过滤膜2-2和二级过滤液导出管道层2-3，二级过滤物提取管道层2-1和二级过滤液导出管道层2-2中间均设置有进样口，二级过滤物提取管道层2-1的进样口左侧和二级过滤液导出管道层2-3的进样口右侧设置有平行支管道，二级多孔过滤膜2-2上均匀设置有若干通孔二。

其中，三级处理结构3包括由上至下依次设置的三级过滤物提取管道层3-1、三级多孔过滤膜3-2和三级过滤液导出管道层3-3，三级过滤物提取管道层3-1和三级过滤液导出管道层3-3中间均设置有进样口，三级过滤物提取管道层3-1的进样口左侧和三级过滤液导出管道层3-3的进样口右侧设置有平行支管道，三级多孔过滤膜3-2上均匀设置有若干通孔三。

其中，四级处理结构4包括由上至下依次设置的四级过滤物提取管道层4-1、四级多孔过滤膜4-2和四级过滤液导出管道层4-3，四级过滤物提取管道层4-1和四级过滤液导出管道层4-3中间均设置有进样口，四级过滤物提取管道层4-1的进样口左侧和四级过滤液导出管道层4-3的进样口右侧设置有平行支管道，四级多孔过滤膜4-2上均匀设置有若干通孔四。

其中，副盖片层6的粘性可撕盖片的制备方法如下：将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂按照10:1的质量比混合。混合后的聚二甲基硅氧烷和80％乙氧基化的聚乙烯亚胺溶液按照10g：40ul的比例混合，搅拌均匀后抽真空预脱气1小时。随后倒入pmma模具框中，放入100℃烘箱加热2h得到。

其中，主盖片层5、过滤物提取管道层和过滤液导出管道层的材质均为聚二甲基硅氧烷，将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂按照10：1的比例混合后抽真空1小时。随后倒入带有单通道结构的阳模模具，放置在70℃烘箱加热2h，固化后脱模得到管道芯片层。

使用过程：

1、对全血预处理微流控装置进行组装：

管道键合按照自底向上的顺序，先将最下层的四级过滤液导出管道层4-3与四级多孔过滤膜4-2经过等离子体处理后不可逆贴合。再键合四级过滤物提取管道层4-1。其余三级处理结构按照上述步骤完成单级结构组合，再将多级结构组合，由主盖片层5封顶，最后将粘性pdms盖片通过裁切成合适大小的形状，可以贴合到芯片最上层，构成副盖片层6。

2、使用全血预处理微流控装置进行全血预处理的方法，包括以下步骤：

(1)准备

使用时，首先保持各个出样口上方盖片揭开状态，从进样口5-9注射血液pbs缓冲液(血液pbs缓冲液的配制方法为：kh2po4、nahpo4·2h2o、nacl和kcl按质量为0.24g、1.44g、8g和0.2g同时加去800ml离子水中，充分搅拌溶解后加浓盐酸调ph至7.4，最后定容至1l)，填满管道，随后将出样口的盖片全部贴上。将pbs缓冲液和血液按照体积比100:1进行稀释制成待处理的全血溶液，进行后一步进样工作。

(2)处理循环肿瘤细胞

a将待处理的全血通过注射器推入平底钢管中，液体样品进入到一级多孔过滤膜1-2上。此时揭开进样口5-9右侧粘性可撕盖片五6-5，在一级过滤物提取出样口5-5位置插入外接离心管的pe管。揭开后对应一级管道与空气连通，在压力作用下，待处理的全血通过一级多孔过滤膜1-2，尺寸大于通孔一孔径8～13μm的颗粒(循环肿瘤细胞)被留在一级多孔过滤膜1-2上面，其余粒径小于通孔一的颗粒以及水分子从一级过滤液导出管道层1-3流出，从pe管顺着一级过滤液导出出样口5-5流出；

b过滤完成后，拔出右侧一级过滤液导出出样口5-5的pe管，重新盖上一级过滤液导出出样口5-5上的粘性可撕盖片五6-5并揭开进样口5-9左侧粘性可撕盖片一6-1。从进样口5-9用注射器通入浸润性好的溶液，比如pbs血液缓冲液将富集的过滤物质(循环肿瘤细胞)洗出。洗出液以及过滤膜上物质从一级过滤物提取出样口5-1顺着外接的pe管流出进入富集离心管。至此完成循环肿瘤细胞从全血中分离、富集、提取。

(3)处理循环肿瘤细胞、白细胞和血细胞

a将待处理的全血通过注射器推入平底钢管中，液体样品进入到聚碳酸酯多孔过滤膜上。此时揭开进样口5-9右侧粘性可撕盖片六6-6，在二级过滤液导出出样口5-6位置插入外接离心管的pe管。揭开后的二级过滤液导出出样口5-6与空气连通，在压力作用下，待处理的全血依次通过一级多孔过滤膜1-2和二级多孔过滤膜2-2，尺寸大于通孔一孔径8～13μm的颗粒(循环肿瘤细胞)被留在一级多孔过滤膜1-2上面，尺寸大于通孔二孔径3～6μm的颗粒(红细胞、白细胞)留在二级多孔过滤膜2-2上，其余物质从二级过滤液导出出样口5-6流出；

b过滤完成后，拔出右侧二级过滤液导出出样口5-6的pe管，重新盖上粘性可撕盖片六6-6。并揭开左侧粘性可撕盖片一6-1或粘性可撕盖片二6-2分别只提取循环肿瘤细胞，或者只提取白细胞红细胞。从进样口5-9外接浸润性好的溶液(比如pbs血液缓冲液)将富集的过滤物质(循环肿瘤细胞或白细胞红细胞)洗出。洗出液以及过滤膜上物质从一级过滤物提取出样口5-1或二级过滤物提取出样口5-2顺着外接的pe管流出进入富集离心管。至此完成循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞从全血中分离、富集、提取。若两种物质实际只需要提取一种，则只完成一次揭开盖片并冲洗操作即可。

(4)处理循环肿瘤细胞、白细胞、血细胞和血小板

a撕开进样口5-9右侧粘性可撕盖片七6-7，保持其他粘性可撕盖片贴合，在压力作用下，待处理的全血依次通过一级多孔过滤膜1-2、二级多孔过滤膜2-2和三级多孔过滤膜3-2，尺寸大于通孔一孔径8～13μm的颗粒(循环肿瘤细胞)被留在一级多孔过滤膜1-2上面，尺寸大于通孔二孔径3～6μm的颗粒(红细胞、白细胞)留在二级多孔过滤膜2-2上，尺寸大于通孔三孔径600nm～2μm的颗粒(血小板)留在三级多孔过滤膜3-2上，其余物质都从三级过滤液导出出样口5-7流出；

b过滤完成后，拔出右侧出样口的pe管，重新盖上出样口6-7的粘性盖片。并依次揭开左侧粘性可撕盖片一6-1、粘性可撕盖片二6-2或粘性可撕盖片三6-3分别只提取循环肿瘤细胞，只提取白细胞红细胞或者单独提取血小板。从进样口5-9外接浸润性好的溶液(比如pbs血液缓冲液)将富集的过滤物质(循环肿瘤细胞或白细胞红细胞或血小板)洗出。洗出液以及过滤膜上物质从一级过滤物提取出样口5-1或二级过滤物提取出样口5-2或三级过滤物提取出样口5-3顺着外接的pe管流出进入富集离心管。至此完成循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞、血小板从全血中分离、富集、提取。

(5)处理循环肿瘤细胞、白细胞、血细胞、血小板和细菌

a撕开进样口5-9右侧粘性可撕盖片八6-8，保持其他粘性可撕盖片贴合，在压力作用下，待处理的全血依次通过一级多孔过滤膜1-2、二级多孔过滤膜2-2、三级多孔过滤膜3-2和四级多孔过滤膜4-2，尺寸大于通孔一孔径8～13μm的颗粒(循环肿瘤细胞)被留在一级多孔过滤膜1-2上面，尺寸大于通孔二孔径3～6μm的颗粒(红细胞、白细胞)留在二级多孔过滤膜2-2上，尺寸大于通孔三孔径600nm～2μm的颗粒(血小板)留在三级多孔过滤膜3-2上，尺寸大于通孔四孔径100nm～300nm的颗粒(各种细菌)留在四级多孔过滤膜4-2上，其余物质都从四级过滤液导出出样口5-8流出；

b溶液过滤完成后，拔出相应的pe管，重新盖上右侧粘性可撕盖片八6-8并揭开左侧粘性可撕盖片四6-4。从进样口5-9外接浸润性好的溶液(如pbs血液缓冲液)将富集的过滤物质洗出。浸润液以及过滤膜上物质从左侧出样口外接的pe管流出进入富集离心管。通过揭开不同的出样口上粘性盖片，就可以控制过滤物和浸润溶液从不同的出样口流出，从而提取出不同的物质。其中，上述所有的注射器均为普通医用5ml注射器，底部尖端针头通过钻头打磨为平底，防止尖端扎破过滤膜。

综上，整个过滤装置分为多级，不同孔径过滤膜用于分离和富集不同大小的颗粒，进样只需要通过注射器一次进样实现。可通过控制出样口上方盖片选择分离某一种或者某几种细胞。

试验例

采用上述实施方式制备各层结构并依次组装完成单级过滤处理结构，对全血溶液进行处理。

(1)配置血液pbs缓冲液并稀释血液

称取kh2po4、nahpo4·2h2o、nacl、kcl质量分别为0.24g、1.44g、8g、0.2g加去离子水800ml，充分搅拌溶解后加浓盐酸调ph至7.4，最后定容至1l配得pbs缓冲液，将pbs缓冲液和全血按照体积比100:1进行稀释混合，得到待处理的血液样本。

(2)使用800纳米多孔薄膜单级处理结构处理样本

揭开出样口上方粘性pdms盖片，并将pe管插入出样口中，pe管外端通入用来盛接过滤后溶液的离心管中。用平底钢针注射器将待处理的血液样本缓缓推入处理结构，过滤后的溶液从pe管流入离心管中。过滤前的血液样本和过滤后的离心管中溶液效果见图4，对比处理前后的血液样本可知，血细胞被有效的分离。

虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。