一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂及其制备方法，由亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、纯水、环氧化合物、硫酸镍和聚乙烯制备而成，取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、纯水充分溶解，并混合均匀；将硫酸镍加入纯水中，配制成硫酸镍溶液；将上述溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的环氧化合物，控制混合液的pH值和温度，加入上述的硫酸镍溶液，室温下进行搅拌反应；结束反应后，用去离子水清洗，即可。本发明所采用的原料主要为一些市场上常见的材料，成本低；制备的树脂重复使用率高，机械强度高，适合大型生产批次使用。该树脂纯化蛋白效率快，纯度高。
【专利说明】
一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及高分子树脂领域，具体是一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]金属螯合亲和层析(MCAC)是近40年来出现的一种亲和层析技术，也称固相化金属离子亲和层析。该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。目前，对于MCAC的研究主要集中在新的金属螯合基质的研究以及层析条件的优化等方面。
[0003]随着我国生物技术的发展，社会对蛋白制品的数量和质量要求逐渐提高，但现阶段我国金属螯合基质多为琼脂糖凝胶，制备工艺复杂，生产周期长，产量低，使用过程易碎裂，易污染，价格昂贵等缺点，非常不利于工业化扩大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂及其制备方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，由以下重量份的原料制备而成:亚氨基二乙酸10?40份，固体氢氧化钠10?40份，纯水150?280份，环氧化合物25?75份，硫酸镍20?50份。
[0006]作为本发明进一步的方案:所述的亚氨基二乙酸替换为氮三乙酸、三羧基甲基乙二胺、N，N-二甲基甲酰胺或羧甲基化天冬氨酸。
[0007]作为本发明进一步的方案:所述的环氧化合物为乙烯系、丙烯酸系、酚醛系或脲醛系等骨架化合物
作为本发明再进一步的方案:所述的环氧化合物替换为缩水甘油醚类、缩水甘油酯类、缩水甘油胺类或脂肪族环氧化合物。
[0008]—种所述的用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂的制备方法，步骤如下:
(1)取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、50?80份纯水充分溶解，并混合均匀；
(2)将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.1?0.2mol/L的硫酸镍溶液；
(3)将步骤(I)中制备的溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的环氧化合物，混合液的pH值控制在9.0?12.0，温度控制在45?75°C，反应20?60h，反应结束后，将得到的树脂清洗干净；
(4)将硫酸镍溶液加入上述的树脂中，室温下进行搅拌，反应2?2.5h;
(5)结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的镍离子，即得到金属螯合树脂。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果是: 本发明制备的金属螯合树脂，基质易得，机械强度大，重复利用率高，价格远远低于琼脂糖树脂或者国外进口同类产品。制备的树脂重复使用率高，机械强度高，适合大型生产批次使用；该树脂纯化蛋白效率快，纯度高。经试验生产验证，本发明完全可以在蛋白纯化领域替代现有产品，推动生物制品行业的发展。
【附图说明】
[0010]图1为纯化前后的蛋白电泳图。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0012]实施例1
用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，由以下重量的原料制备而成:亚氨基二乙酸10g，固体氢氧化钠1g，纯水150g，聚乙烯环氧树脂25g，硫酸镍20g。
[0013]上述金属螯合树脂的制备步骤如下:
(1)取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、50g纯水充分溶解，并混合均匀；
(2)将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.lmol/L的硫酸镍溶液；
(3)将步骤(I)中制备的溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的聚乙烯环氧树脂，混合液的pH值控制在9.0?12.0，温度控制在45°C，反应60h，反应结束后，将得到的树脂清洗干净；
(4)将硫酸镍溶液加入上述的树脂中，室温下进行搅拌，反应2h;
(5)结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的镍离子，即得到金属螯合树脂。
[0014]
实施例2
用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，由以下重量的原料制备而成:三羧基甲基乙二胺25g，固体氢氧化钠25g，纯水220g，聚丙烯酸环氧树脂50g，硫酸镍35g。
[0015]上述金属螯合树脂的制备步骤如下:
(1)取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、65g纯水充分溶解，并混合均匀；
(2)将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.15mol/L的硫酸镍溶液；
(3)将步骤(I)中制备的溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的聚丙烯酸环氧树脂，混合液的pH值控制在9.0?12.0，温度控制在600C，反应30h，反应结束后，将得到的树脂清洗干净；
(4)将硫酸镍溶液加入上述的树脂中，室温下进行搅拌，反应2.5h;
(5)结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的镍离子，即得到金属螯合树脂。
[0016]
实施例3
用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，由以下重量的原料制备而成:羧甲基化天冬氨酸40g，固体氢氧化钠40g，纯水280g，脂肪族环氧树脂75g，硫酸镍50g。
[0017]上述金属螯合树脂的制备步骤如下:
(1)取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、SOg纯水充分溶解，并混合均匀；
(2)将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.2mol/L的硫酸镍溶液；
(3)将步骤(I)中制备的溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的脂肪族环氧树脂，混合液的pH值控制在9.0?12.0，温度控制在75°C，反应25h，反应结束后，将得到的树脂清洗干净；
(4)将硫酸镍溶液加入上述的树脂中，室温下进行搅拌，反应2.5h;
(5)结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的镍离子，即得到金属螯合树脂。
[0018]
试验例
取某酶蛋白发酵表达菌体I OOg，加入500ml缓冲液搅拌均匀，再用均质机破碎细胞，离心收集上清液。将实施例2制备的镍离子金属螯合树脂10g装入层析柱内，使用0.lmol/L磷酸盐缓冲液平衡Ih;再将蛋白上清液以3Bv/h的流速进行上样吸附；吸附结束后，先使用纯水洗涤层析柱30min，再使用5mmol/L咪卩坐溶液洗涤层析柱30min，最后使用300mmol/L咪挫溶液(pH=8.0)进行目的蛋白洗脱，收集洗脱液，分别对离心清夜和洗脱液进行电泳检测，图谱如图1所示。
[0019]标注:I是纯化后蛋白；2是纯化前蛋白。
[0020]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
【主权项】
1.一种用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，其特征在于，由以下重量份的原料制备而成:亚氨基二乙酸10?40份，固体氢氧化钠10?40份，纯水150?280份，环氧化合物25?75份，硫酸镍20?50份。2.根据权利要求1所述的用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，其特征在于，所述的亚氨基二乙酸替换为氮三乙酸、三羧基甲基乙二胺、N，N-二甲基甲酰胺或羧甲基化天冬氨酸。3.根据权利要求1所述的用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，其特征在于，所述的环氧化合物为乙烯系、丙烯酸系、酚醛系或脲醛系等骨架化合物。4.根据权利要求1所述的用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂，其特征在于，所述的环氧化合物替换为缩水甘油醚类、缩水甘油酯类、缩水甘油胺类或脂肪族环氧化合物。5.—种如权利要求1所述的用于蛋白亲和纯化的金属螯合树脂的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)取亚氨基二乙酸、固体氢氧化钠、50?80份纯水充分溶解，并混合均匀； (2)将硫酸镍加入纯水中，配制成摩尔浓度为0.1?0.2mol/L的硫酸镍溶液； (3)将步骤(I)中制备的溶液放入恒温水浴锅的烧杯中，加入清洗干净后的环氧化合物，混合液的pH值控制在9.0?12.0，温度控制在45?75°C，反应20?60h，反应结束后，将得到的树脂清洗干净； (4)将硫酸镍溶液加入上述的树脂中，室温下进行搅拌，反应2?2.5h; (5)结束反应后，使用去离子水清洗未反应完全的镍离子，即得到金属螯合树脂。
【文档编号】C08G59/52GK106076294SQ201610582075
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月22日 公开号201610582075.4, CN 106076294 A, CN 106076294A, CN 201610582075, CN-A-106076294, CN106076294 A, CN106076294A, CN201610582075, CN201610582075.4
【发明人】杨龙
【申请人】杨龙