专利名称：一种提高虫草菌素含量的方法
技术领域：
本发明涉及药物配制品的原料，具体来说，涉及含生物有机有效成分的医药原料，特别涉及虫草菌素的生产方法。
背景技术：
虫草菌素(Cordycepin)即3′-脱氧腺苷(3′-Deoxyaadenosine)又称虫草素、蛹虫草菌素，为一种细胞毒性物质。虫草菌素的分子式为C10H13N5O3，分子量251，碱性，针状或片状结晶，熔点230～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反应阳性，紫外光的最大吸收波长为259nm。虫草菌素的结构式如下 在虫草菌素的生物合成期间，腺苷直接转化成3’-脱氧腺苷而无碳-氮糖苷键的断裂，即虫草菌素的合成是以腺苷为直接前体。
虫草菌素具有抑菌、抗肿瘤、抑制病毒、杀蚊虫、抑制蛋白质激酶、抑制核酸甲基化等多种生物学活性。作为区别细胞中不同RNA聚合酶的工具，已引起药学界的重视。近年来，人们加强了提取虫草菌素的研究，取得了一些成果，典型的例子如中国专利申请件00130376号、00134688号、01124109号、01126910号等。但由于天然蛹虫草中虫革菌素含量不高，一般为0.1％～0.4％，势必导致用提取的虫草菌素作为虫草抗癌一类中药的药源，价格昂贵，很难满足临床上的广泛使用；同时现有技术提取虫草菌素的周期较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高发酵菌丝体中虫草菌素含量并缩短高产虫草菌素生产时间的方法，以克服虫草菌素现有技术的缺陷。
发明人经过长期的系统研究和试验后，提出的方法包括(1)将选定的菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；(2)用接种环取斜面母种孢子粉，接于液体母种培养基中，常温下摇瓶培养，得到液体母种；(3)在发酵培养基中，加入氢氧化钾，高温灭菌后冷却，用盐酸调节pH值，再将液体母种接入，常温下进行摇瓶培养，得到发酵菌丝体；(4)将菌丝体及发酵液全部转入离心管中，离心分离菌液，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，重复离心，将培养基基本洗去后，收集菌丝体，烘至恒重，然后研磨成粉，过筛，制得虫草菌素含量大于2％的干菌丝粉。
在上述液体母种培养中，培养基装量的体积分数为20％。
在上述发酵菌丝体的培养中，所用的培养基是将豆浆中含腺苷2mg/ml的量加进蛋白胨2％、酵母膏3％、麦芽糖3％、蔗糖4％而配成的；加入KOH的量为0.3mol/L；用来调节pH的盐酸浓度为3mol/L。
在上述菌丝体及发酵液的离心分离过程中，所用的离心分离转速为2500r/min，一次离心分离时间为10min，通常进行3次离心分离。
在上述菌丝体的烘干过程中，常用的烘干温度为55℃。
上述制成的干菌丝粉可以采用对照标准曲线法和内标法相结合的方法，用紫外分光光度器测定虫草菌素含量，具体的测定方法如下(1)精密称取干菌丝粉置于具塞试管中，加入乙醇，用水浴加热，补加乙醇至刻度，双层滤纸过滤，精确取滤液于具塞试管中，用乙醇稀释至刻度得供试样品液；(2)将供试样品液于752型紫外分光光度计259nm处，以乙醇为空白，将对照标准曲线法和内标法结合起来，测定样品液的吸光度，由此测得发酵菌丝体虫草菌素含量。
本发明提供了一种提高发酵菌丝体中虫草菌素含量的方法，制得的发酵菌丝体虫草菌素含量高于2％，并将产虫草菌素的时间缩短到只需48h，该发酵菌丝体可以直接作为保健食品，还可以用作虫草抗癌一类中药的药源；此法易操作，生产周期短，其成本低，适合工业化生产。
图1为本发明方法的框图。
具体实施例方式
下面通过实例对本发明作进一步的详细说明实施例用保藏于贵州大学真菌资源研究所的微生物菌种96-0706转接于PDA斜面培养基(土豆、葡萄糖和琼脂)上，在27℃下培养7d，活化三次，得到斜面母种；之后用接种环取3-4环斜面母种孢子粉，接于蛋白胨2％，蔗糖2％，MgSO40.05％，KH2PO40.1％的液体母种培养基中，培养基装量的体积分数为20％，在27℃下，以140r/min的转速摇瓶培养84h，得到液体母种，其中的菌丝体相互紧密纠缠形成颗粒，均匀地悬浮在培养液中，菌丝球经肉眼观察细小且均匀，呈奶黄色，有淡淡的香味；显微镜观察具有致密的网状结构，无空胞出现；然后将豆浆中含腺苷2mg/ml的量加进发酵培养基中，该发酵培养基是经多次实验(先单因素，再正交设计)筛选出来的，配方为蛋白胨2％、酵母膏3％、麦芽糖3％、蔗糖4％；将KOH以0.3mol/L的量加入，121℃，灭菌30min，冷却，用7N盐酸调pH为7.0，再将液体母种以7％的量接入，在27℃下，以140r/min的转速摇瓶培养48h，得到发酵菌丝体；最后将菌丝体及发酵液全部转入离心管中，在2500r/min下离心10min，进行菌液分离，去其上清夜，用双蒸水冲洗菌丝，再离心，重复三次，将培养基基本洗去后，收集菌丝体，55℃烘至恒重，然后研磨成粉，过60目筛，得到干菌丝粉。测定时将精密称取的干菌丝粉0.2g置于20ml具塞试管中，加入20％乙醇1.2ml，用50℃水浴加热30min，补加20％乙醇至刻度，双层滤纸过滤，精确取滤液0.5ml于5ml具塞试管中，20％乙醇稀释至刻度得供试样品液；再将供试样品液于752型紫外分光光度计259nm处，以20％乙醇为空白，将对照标准曲线法和内标法结合起来，测定样品液的吸光度，由此测得发酵菌丝体虫草菌素含量为2.36％。
权利要求
1 一种提高发酵菌丝体中虫草菌素含量的方法，其特征包括(1)将选定的菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；(2)用接种环取斜面母种孢子粉，接于液体母种培养基中，常温下摇瓶培养，得到液体母种；(3)在发酵培养基中，加入氢氧化钾，高温灭菌后冷却，用盐酸调节pH值，再将液体母种接入，常温下进行摇瓶培养，得到发酵菌丝体；(4)将菌丝体及发酵液全部转入离心管中，离心分离菌液，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，重复离心，将培养基基本洗去后，收集菌丝体，烘至恒重，然后研磨成粉，过筛，得到虫草菌素含量大于2％的干菌丝粉。
2 如权利要求1所述的提高发酵菌丝体中虫草菌素含量的方法，其特征在于在所述发酵菌丝体的培养中，所用的培养基是将豆浆中含腺苷2mg/ml的量加进蛋白胨2％、酵母膏3％、麦芽糖3％、蔗糖4％而配成的；加入KOH的量为0.3mol/L；用来调节pH的盐酸浓度为3mol/L。
3 如权利要求1所述的提高发酵菌丝体中虫草菌素含量的方法，其特征在于在所述菌丝体及发酵液的离心分离过程中，所用的离心分离转速为2500r/min，一次离心分离时间为10min，通常进行3次离心分离。
全文摘要
一种提高虫草菌素含量的方法，涉及含生物有机有效成分的医药原料，发明的方法是(1)将选定的菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；(2)取斜面母种孢子粉，接于液体母种培养基中，常温摇瓶培养，得到液体母种；(3)在发酵培养基中，加入氢氧化钾，高温灭菌后冷却，用盐酸调节pH值，再将液体母种接入，常温摇瓶培养，得到发酵菌丝体；(4)将菌丝体及发酵液转入离心管中，离心分离菌液，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，重复离心，洗去培养基后，收集菌丝体，烘至恒重，然后研磨成粉，过筛，制得虫草菌素含量大于2％的干菌丝粉。该菌丝可作保健食品，还可用作抗癌药的药源；此法易操作，生产周期短，成本低，适于工业生产。
文档编号C12P19/00GK1472330SQ0313529
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月23日 优先权日2003年6月23日
发明者梁宗琦, 李祝, 刘爱英, 韩燕峰 申请人:贵州大学