专利名称：以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法
技术领域：
本发明属于可再生生物能源领域，涉及以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法。
背景技术：
随着全球原油价格的不断攀升以及温室效应的加重，近几年各国纷纷加大对生物燃料的研发力度和推广应用。生物柴油作为一种清洁的替代燃料，它可生物降解、无毒、几乎不含硫和芳香类化合物，并且使用方便，不需要对发动机进行改造或者只做微小改动就可以直接使用生物柴油或者将生物柴油与石化柴油接任意比例调和后使用(Palligarnai T et al.Bio dieselproduction—current state of the art and challenges.J IndMicrobiol Biotechnol.2008)。
生物柴油是一种生物质能，其生产原料十分广泛，既可用玉米、木薯、高粱等淀粉类作物以及甘蔗、甜菜等糖类作物，还可以用大豆、蓖麻、油菜籽、麻风树等油料作物，不受地理等影响，可以因地制宜种植生物柴油原料植物，形成绿色能源储备库，加上生物柴油的生产不受地理环境的影响，可免去勘探、钻井、采矿及长途运输等环节，利于普及和推广(M.Canakciand H.Sanli.Biodiesel production from various feedstocks andtheir effects on the fuel properties.J Ind Microbiol Biotechnol.2008，35431-441)。因此，生物柴油的布局更合理，在能源上更加独立，使得各国的能源不易受到别国的干涉和控制，减少对石油市场的依赖。
生物柴油的生产技术和使用技术已经比较成熟。早期利用高温裂解生产汽油、柴油，但是转化率低、能耗高、经济性差，现在生物柴油生产技术主要可以分为物理法和化学法。其中酯化/酯交换是生物柴油的主要生产方法，即用含或不含游离脂肪酸的油脂和醇等进行酯化或转酯化反应，生成相应的脂肪酸低碳烷基酯，再经分离甘油、水洗、干燥等适当后处理即得生物柴油。通过化学转化得到的脂肪酸低碳烷基酯完全具有石化柴油几乎相同的流动性和粘度范围，同时具有与石化柴油的完全互溶性，是一种良好的柴油内燃机动力燃料(庄静，周熙荣，孙超才，王伟荣，李延莉，顾龙弟，钱小芳。利用植物油脂生产生物柴油技术和方法的研究进展。上海农业学报。2006年，04期；王晓东。生物柴油的制备技术及应用现状。工业催化。2008年，08期；黄世丰，陈国，方柏山。酯化及转酯化法制备生物柴油过程中催化剂的研究进展。化工进展。2008年，27卷4期)。
经过国内外多年的探索，从众多能源原料作物中脱颖而出的能源甘蔗备受关注，20世纪70年代后期就已经利用甘蔗的热带种S.officinarum同热带斑茅属植物杂交育并筛选出了高生物量的甘蔗品种，其特点在于生长快、生物量高、可发酵糖的含量高以及纤维含量高(Edme SJ，Miller JD，Glaz B，Tai PY-P，Comstock JC.Genetic contribution to yield in the Floridasugarcane industry accross 33 years.Crop Science.2005，4592-97)，并且甘蔗是作物中对太阳能利用率最高的作物之一，因而能充分转化太阳能为贮藏能。最有说服力的就是巴西经验，为应对上世纪以来的几次世界石油危机，减少对石油进口的依赖，巴开充分利用本国的甘蔗种植优势，制定了以甘蔗为主要原料的燃料乙醇计划。目前该国已经掌握了生产酒精燃料的成熟技术，成为世界上最大的酒精出口国之一，也是以酒精为汽车燃料最为成功的国家之一(Gisella M.Zanin et al.Brazilian Bioethanol Program.Applied Biochemistry andBiotechnology.2000，Vol.84-861147-1161)。上述这些事实证明甘蔗是一种优质的生物燃料生产原料。
对于目前的现有技术而言，将甘蔗作为原料生产生物燃料是指燃料乙醇的生产，该现有技术主要包括用厌氧微生物，如酵母，对甘蔗中的可发酵糖(其中包括蔗糖、还原糖以及其他可被生物所利用的单糖、二糖以及多糖)进行厌氧发酵，然后将发酵液脱去水分进而生产出燃料乙醇(Kevin A Gray et al.Bioethanol.Current Opinion in Chemical Biology.2006，10141-146)。然而，实现将甘蔗作为原料生产生物柴油的技术尚无报道。和燃料乙醇相比，生物柴油的热值高于乙醇，完全燃烧可以释放出更多的热量；用乙醇作为原料需要对现有汽车的制动装置和/或设备进行改造，而用生物柴油作为燃料则不需要对汽车进行改造就可以直接使用，从而节省了汽车制造业的研发和改造成本(安晓东，李冠峰，李洲。乙醇与生物柴油应用对比分析和市场化前景。农机化研究。2008年，08期)；在目前的燃料乙醇生产流程中，需要耗费大量的电能对含有乙醇的发酵液进行蒸馏以便除去过多的水分，而生物柴油的生产过程中不需要该步骤；生物柴油生产过程中的副产物是甘油，这是一种非常有用的化学产品(何延青，吴永强，闻建平。生物柴油生产及其副产物甘油的有效利用。中国油脂，2007年，第32卷，第05期)。
小球藻为绿藻门小球藻属(Chlorella)单细胞绿藻，生态分布广，易于培养，生长速度快。小球藻细胞除了可在自养条件下利用光和二氧化碳进行正常的生长外，还可以在异养条件下利用有机碳源，如葡萄糖，进行快速生长繁殖并且在细胞内积累大量油脂(魏东，刘龙军。异养小球藻产总脂肪酸的培养基优化。化学与生物工程。2008年，03期；闫海，张宾，王素琴，李雅雯，刘硕，杨帅。小球藻异养培养的研究进展。现代化工。2007年，第4期)，细胞的生长主要依赖细胞对有机碳源的吸收，因此可以通过流加策略等工业手段实现高密度发酵和脂肪的高效合成。清华大学吴庆余课题组以一株既能自养又能异养生长的绿藻Chlorella protothecoides为材料，率先开展了利用异养微藻来生产生物柴油的研究，目前通过建立合理的补料流加策略，异养小球藻的培养密度可达100gL-1，油脂含量超过细胞干重的50％，这种微藻油脂同样也是一种潜在的生产生物柴油的原料来源(Miao XL，Wu QY.Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil.BioresourTechnol.2006.97841-6；Xu H，Miao XL，Wu QY.High qualitybiodiesel production from microalga Chlorella protothecoides byheterotrophic growth in fermenters.J Biotechnol.2006.126499-507；Li XF，Xu H，Wu QY.Large-scale biodieselproduction from microalga Chlorella protothecoids throughheterotrophic cultivation in bioreactors.Biotechnology andBioengineering.2007.98(4)764-71；Xiong W，Li XF，Xiang JY，et al.High Density Fermentation of Microalga ChlorellaProtothecoides in Bioreactor for Microbio-Diesel Production.Applied Microbiology and Biotechnology.2008，7829-36)。
在利用小球藻来生产生物柴油方面，已经有相关专利对此进行了描述。例如中国专利申请公开CN1446882A公开了用淀粉酶解培养异养藻制备生物柴油的方法，其利用酶解淀粉制葡萄糖水溶液配制培养液，通过异养转化培养技术获得高脂肪含量的异养藻细胞，再用高脂肪含量的异养藻快速热解制备得到生物柴油。中国专利申请公开CN101230364A公开了一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法，其通过高生长速率与高脂肪含量藻种的筛选、接种并进行二级发酵，得到高密度培养的异养小球藻细胞，经过分离、收集并干燥、抽提藻油，再经过转酯化反应制备生物柴油。但是这些方法需要复杂的培养基配制过程，需要添加额外的物质，步骤繁琐，成本较高，在大规模工业化生产上存在一定缺陷。
考虑到以上所述方面，我们设计了一种利用甘蔗中的可发酵碳源生产生物柴油的方案。微藻将甘蔗中的碳源转化为油脂并在细胞内大量积累，积累的油脂提取后经过转酯反应而生成生物柴油。这不仅降低生产生物柴油的原料成本，也巧妙的填补了利用甘蔗来生产生物柴油的技术空缺，为甘蔗的全面开发利用提供了一种新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，具体的说，本发明的大体过程为以甘蔗汁为原料，首先将甘蔗汁中的多糖转化成产油微藻能够直接利用的单糖，得到甘蔗汁降解液，再利用甘蔗汁降解液培养产油微生物获得油脂，然后从获得的油脂制备生物柴油。
本发明的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，包括以下步骤 (1)从甘蔗提取甘蔗汁； (2)将甘蔗汁中多糖转化成单糖，获得甘蔗汁降解液； (3)利用甘蔗汁降解液培养产油微藻； (4)从产油微藻获得油脂； (5)从油脂制备生物柴油。
其中所述步骤(2)中的转化方法可为酸法降解、碱法降解或酶法降解，优选酶法降解。酶法降解可以利用蔗糖转化酶进行。
酶法降解中酶的加入量为每100kg底物130-400g酶，优选每100kg底物300g酶，反应时间30分钟。
所述的产油微藻优选为小球藻，更优选为原始小球藻(Cholorella protothecoides)。
在所述步骤(3)中培养产油微藻的方法为使用三角摇瓶培养，培养温度为10-40摄氏度，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度；摇床旋转速度为100-300rpm，优选150-250rpm，最优选220rpm；pH为5.0-7.5，优选6.0-7.0，更优选6.3，可发酵碳源浓度为10-30g/L，优选30g/L。
在所述步骤(3)中培养产油微藻的方法还可为使用发酵罐培养，培养温度为10-40摄氏度，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度；搅拌速度为100-500rpm，优选200-400rpm，最优选350rpm；pH为5.0-7.5，优选6.0-7.0，更优选6.3；溶解氧饱和度维持在5-50％，优选10-40％，可发酵碳源浓度为10-30g/L，优选30g/L。
在所述步骤(4)中从产油微藻获得油脂的方法为压榨法、裂解法、有机溶剂抽提、破碎细胞或超临界流体技术。
在所述步骤(5)中采用酯化反应从油脂制备生物柴油。
采用本发明方法，在将甘蔗汁中多糖转化成单糖，获得甘蔗汁降解液后，无需添加其它营养因子即可直接用于培养小球藻，不仅简化培养过程，还降低生产成本。这对于大规模的生物量生产以及油脂的生产而言，都是极为有利的。
图1表示在实施例1摇瓶培养中，小球藻的细胞密度和培养液中还原糖浓度随培养时间的变化。
其中，实心圈表示细胞密度，空心方块表示还原糖浓度。数值为平行取样3次的平均值。
图2中A图表示用尼罗红染色方法对培养起始阶段的细胞进行的染色。B图表示用尼罗红染色方法对培养结束时的细胞进行的染色。
其中，横坐标为波长，纵坐标为荧光信号强度，其中500nm-650nm区域为中性脂的信号区域。
图3表示在实施例2的5L发酵罐中，小球藻的细胞密度和培养液中还原糖浓度随培养时间的变化。
其中，空心方块表示细胞密度，实心圈表示还原糖浓度。
图4为葡萄糖培养基和甘蔗汁完全培养基用于小球藻培养的比较。
其中，▲和■表示细胞密度，△和□表示残留的还原糖浓度，■和□表示葡萄糖对照，▲和△表示甘蔗汁完全培养基。
图5为甘蔗汁酶解液(未补加其他营养因子)和甘蔗汁完全培养基用于小球藻培养的比较。
其中，●和▲表示细胞密度，○和△表示残留的还原糖浓度，▲和△表示甘蔗汁完全培养基，●和○表示甘蔗汁酶解液(未补加其他营养因子)。
图6为尼罗红染色荧光谱。
其中，(实线)葡萄糖，(虚线)甘蔗汁酶解液。双箭头指示570nm位置。
图7为不同浓度甘蔗汁酶解液(不额外添加其他营养因子)对小球藻培养的影响。
其中，还原糖浓度分别为■5g L-1，●10g L-1，▲15g L-1，□25g L-1，○30g L-1。
具体实施例方式 术语 除非另有指明，否则本说明中所用的所有技术和科学术语与本发明涉及技术领域的普通技术人员的常规理解有相同含义。
如此处所用，术语“生物柴油”根据美国试验与材料学会(ASTM)生物柴油D-6751标准，定义为从可再生脂质资源，如植物油或动物脂中得到的长链脂肪酸烷基单酯，是由长链脂肪酸的单烷基酯组成的燃料(Specification for Biodiesel(B100)-ASTM D6751)。其中“生物”表示它相对于石化柴油而言，是一种可再生的生物资源；“柴油”指的是它可用于柴油发动机。
如此处所用，术语“转酯反应”(也作“酯交换反应”、“酯交换”)是指酯与醇在酸或碱的催化下生成一个新酯和一个新醇的反应，即酯的醇解反应。
如此处所用，术语“异养”是指生物不能直接利用无机物合成有机物，必须摄取现成的有机物来维持生活的营养方式。
如此处所用，术语“还原糖”是指能够还原斐林(H.vonFehling)试剂或托伦斯(B.Tollens)试剂的糖称为还原糖，所有的单糖，不论醛糖、酮糖都是还原糖，如果糖、葡萄糖。部分双糖也是还原糖，但蔗糖不是。例如在本发明中，甘蔗中的可发酵糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖以及其他可被生物所利用的单糖、二糖以及多糖，对甘蔗汁进行酶法降解之后，认为酶解液中得到的是一种以果糖和葡萄糖等还原糖类为主要成分的混合物，因而在本发明的上下文中，还原糖也可以理解为酶解液中的这些成分。
如此处所用，术语“中性脂”、“中性脂肪”、“油脂”或“甘油三酯”在本说明中可以互相替换。甘油三酯是指由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成的脂肪分子。绝大多数是混合的三酰甘油，即含有两种或三种不同的脂肪酸的三酰甘油。甘油三酰在常温下(25℃)呈固态者称为脂；在常温下呈液态者称为油。一般情况下，中性脂主要是指甘油三酯。
以下将详细地介绍本发明的具体步骤。
本发明的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，包括 (1)从甘蔗提取甘蔗汁； 本发明的最终目的是利用产油微藻将甘蔗中的可发酵碳源转化为油脂，进而制备生物柴油。其中所述可发酵碳源是指任何可以被微生物以任何方式所利用的碳源。甘蔗中的碳源以多种形式存在，例如甘蔗外皮中，碳源主要是指纤维素和木质素等有机化合物；在甘蔗汁中，碳源主要包括但不限于蔗糖、蔗糖衍生的产物、葡萄糖、果糖以及其他可以利用的碳源。成熟的原料蔗(原料蔗是指蔗茎，不包括蔗叶、蔗梢和蔗根)一般含水分约70％-77％、蔗糖约12％-18％、葡萄糖约0.4％-1.5％、纤维约9.5％-12％、非糖有机物约0.7％-1.0％、无机物约0.5％-1.4％。甘蔗汁中水分约占76％-85％、可溶性碳水化合物约占13％-22％、其它成分约占1.2％-2.8％，其中所述可溶性碳水化合物主要成分是蔗糖、葡萄糖和果糖(陈平华。甘蔗主成分分析及作为再生能源的可行性。甘蔗。2004年，02期)。
小球藻可以利用多种有机和无机碳源，在小球藻的异养培养中优选利用六碳糖作为有机碳源，更优选利用葡萄糖和/或果糖作为有机碳源(闫海，张宾，王素琴，李雅雯，刘硕，杨帅。小球藻异养培养的研究进展。现代化工。2007年，第4期)。因而，优选使用甘蔗汁作为可发酵碳源的形式，甘蔗汁的获取步骤包括 ①将甘蔗制备成小块和/或碾轧甘蔗破坏其坚硬外皮结构，以便更有效的提取更多甘蔗汁。可以使用工业制造领域中任何适合的人工、自动化、半自动化装置处理和/或碾轧甘蔗，包括但不限于刀、辊轴、甘蔗削皮机、甘蔗皮切割装置、滚筒式切割机、甘蔗糖厂高强度耐磨切蔗机、斧型式和/或钉型式甘蔗撕解机等； ②榨取①中处理过的甘蔗，并收集甘蔗汁。可以使用工业制造领域中任何适合的人工、自动化、半自动化装置榨取甘蔗汁，包括但不限于离心设备、台式、立式、手摇式甘蔗榨汁机、家用甘蔗榨汁机、糖厂压榨机、压榨辊轴等。
(2)将甘蔗汁中的多糖进行降解，使其中的碳源转化成适于产油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液； 将甘蔗汁中的碳源转变成适于特定微生物物种利用的形式，对于微藻，尤其是小球藻而言，优选将甘蔗汁中的碳源转变为单糖形式，因此甘蔗汁中的碳源转变方式优选是指将蔗糖降解为单糖。为了向小球藻提供甘蔗中的可发酵碳源，可以利用本领域公知的任何合适的方法将蔗糖降解为单糖，方法包括但不限于酸法降解、碱法降解和酶法降解，从而得到甘蔗汁降解液。在一个优选实施方案中优选使用酶法降解蔗糖，更优选使用蔗糖转化酶降解蔗糖。酶加入的量以及反应时间对于本领域技术人员而言是显而易见的，可以轻易的根据酶制造商提供的说明书或者本领域相关文献来做出改进或决定。本发明按照每100kg底物130-400g酶的比例加入酶，优选每100kg底物加入300g酶，反应时间优选30分钟。因为甘蔗汁中主要碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖，因此，经过酶解之后获得的碳源主要是指果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖是还原糖，因而可以用DNS法测定。反应结束后，本发明按照DNS法测量酶解液。所得酶解液可以稀释或者浓缩之后使用。
以上获得的甘蔗汁降解液中，不仅含有可供微藻特别是小球藻利用的可发酵碳源，还包括供其利用的氮源等。本发明人意外地发现，经过降解的甘蔗汁，已经包含了微藻生产所需的各种营养元素，无需再添加任何其它物质，灭菌后即可直接利用。这避免了目前产油微藻培养技术中培养基配置繁杂，需要使用纯品试剂，成本较高的缺点，简化了生产步骤，降低了生产成本。对于大规模的生物量生产以及油脂的生产而言，都是极为有利的。
将上述甘蔗汁降解液进行灭菌处理后，获得最终的培养液，将该培养液用于小球藻的培养。可以使用本领域公知的任何合适的灭菌方法处理上述生产生物柴油的原料，包括但不限于物理辐射、过滤、高温高压灭菌和/或添加化学添加剂。在一个实施方案中，优选采用蒸汽灭菌法处理原料。
(3)利用甘蔗汁降解液培养产油微生物，特别是产油微藻； 产油微生物为任何具有油脂生产能力的微生物，优选产油微藻，更优选小球藻，最优选原始小球藻(Cholorellaprotothecoides)。
小球藻异养培养的过程包括①将小球藻接种至灭菌处理的甘蔗汁降解液中。小球藻在异养状态下利用培养基中的有机碳源作为唯一碳源用于维持生理活动并积累油脂。②小球藻利用甘蔗汁中的可发酵碳源进行异养生长和繁殖，并在体内积累油脂。
可以使用本领域公知的任何合适的容器和/或设备进行培养，包括但不限于发酵罐、摇瓶、通气瓶、培养箱、摇床、泵、冷凝设备、监控设备。
在一个实施方案中，在恒温摇床中使用三角摇瓶培养小球藻。小球藻在10-40摄氏度范围内均可以生存，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度。摇床旋转速度可以是100-300rpm，优选150-250rpm，最优选220rpm。pH在5.0-7.5之间，优选6.0-7.0，更优选6.3。
在另一个实施方案中，优选在28摄氏度，220rpm，pH6.3，常压下培养小球藻，一次性向小球藻提供培养基。也可以在发酵罐中对小球藻进行异养发酵。发酵罐的培养规模可以是从1L至数十吨，甚至更大规模。小球藻在10-40摄氏度范围内均可以生存，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度。搅拌速度可以是100-500rpm，优选200-400rpm，最优选350rpm。pH在5.0-7.5之间，优选6.0-7.0，更优选6.3。溶解氧饱和度维持在5-50％左右，优选10-40％左右，由于溶解氧对于培养液的条件变化敏感，随着补料、搅拌速度、细胞密度、培养基成分、通气量等的变化而变化，因此，此处所述“左右”是有必要并且有意义的，不应理解为表述模糊不清。在一个实施方案中，优选在5L发酵罐中对小球藻进行异养发酵，在28摄氏度，350rpm，pH6.3，溶解氧饱和度维持在10-40％左右，常压下对小球藻进行发酵，采用流加策略向小球藻提供营养物质，使得可发酵碳源浓度维持在10-30g/L。
培养期间，可以定时监测细胞密度、可发酵碳源浓度以及细胞内油脂的积累随时间的变化，取样间隔可以是但不限于每48小时、每36小时、每24小时、每12小时、每6小时、每3小时、每1小时。考虑到实验材料自身的生长特性，本发明优选每24小时平行取样3次进行测定，取平均值。培养过程中细胞密度通过分光光度计测定光密度值(OD540nm)来估算。OD540nm与细胞干重的线性关系可以用以下公式表示y＝0.4155x，(R2＝0.9933，P<0.05)，其中y表示细胞密度(g L-1)，x表示540nm处光吸收密度值。使用DNS法来测量培养基中还原糖的浓度，因为本发明中的可发酵碳源主要是由甘蔗汁酶解液中可被DNS所探测到的还原性碳源所组成的，因此在本发明中利用DNS法测得的还原糖浓度来表示可发酵碳源浓度。使用尼罗红染色法来评价油脂在藻细胞中的积累情况。
(4)从产油微藻获得油脂； 从产油微生物，特别是从小球藻中获得油脂的方法，包括 ①在培养结束时收集异养培养的小球藻。细胞的收集方法是本领域技术人员公知的，如离心、过滤、吸附等。在一个实施方案中，本发明利用离心的方法收集培养容器中的小球藻细胞； ②为了便于油脂的获得，优选将细胞进行干燥之后再进行油脂的提取。可以使用任何合适的干燥方法，如冷冻干燥、烘干、晾晒等。在一个实施方案中，本发明优选使用冷冻干燥的方法对收集的细胞进行干燥。
③从小球藻细胞中提取并收集油脂。可以使用任何合适的方法获得油脂，包括但不限于压榨法、裂解法、有机溶剂抽提、破碎细胞、超临界流体技术。小球藻细胞中积累的油脂以中性脂肪为主，根据有机化学中的相似相容原理，选择适当的非极性溶剂来提取油脂，由于非极性溶剂能较易溶解非极性物质，所以可以采用任何适合的溶剂和/或溶剂组合按照适当的比例来提取微藻油脂，包括但不限于正己烷、汽油、四氯化碳、正己烷和异丙醇的化合物等。本领域技术人员可以轻易的选择和优化有机溶剂的类型、添加比例和提取时间。在一个实施方案中，本发明优选在油脂提取之前用研磨的方法将小球藻细胞破碎，可以采用任何合适的方法来破碎细胞，优选使用石英砂机械研磨来破碎细胞，然后使用正己烷抽提细胞中积累的中性油脂，抽提时间5分钟-1小时，优选10-30分钟，优选15分钟左右。含有油脂的正己烷经旋转蒸发仪处理，将正己烷除去后收集获得的油脂。
本发明的目的在于获得藻细胞内的油脂，因此培养结束的判断可以通过监测培养期间的细胞密度和细胞内油脂的积累随时间的变化情况，以及监测培养基中可发酵碳源的消耗情况来实现。所述的油脂监测方法可以是本领域中任何合适的方法，例如核磁共振、尼罗红染色、流式细胞术等；所述的碳源消耗在本发明中主要是指甘蔗汁中可溶性的糖以及蔗糖的衍生产物的消耗，可以使用本领域公知的合适的方法来进行测量，可以使用本领域公知的合适的方法来测量细胞密度。在一个实施方案中，本发明使用尼罗红染色法来评价油脂在藻细胞中的积累情况，并且使用3，5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)来测量培养基中还原性糖类的浓度，从而间接了解碳源的消耗以及碳源对油脂的转化情况，利用分光光度计监测细胞密度。当具有以下特征的一项、两项、所有或其组合时，就认为培养达到终点①细胞密度增加生长达到平台期；②培养基中碳源耗尽；③藻细胞中油脂积累达到平台期。
(5)从油脂制备生物柴油 本发明采用酯化反应将微藻油脂转化为生物柴油。脂肪酸到脂肪酸酯的转化包括但不限于强酸催化(如浓硫酸)、脂肪酶催化等。在一个实施方案中，本发明采用酸法催化制备生物柴油，优选采用浓硫酸催化。所用的醇优选为甲醇，醇油摩尔比优选30:1，反应最好在55℃的恒温摇床中进行，转速约160rpm，反应48h。反应结束后，混合反应体系分成上下两层，分离位于上层的生物柴油，并置于30℃的温水中淋洗，旋转蒸发，去除溶剂，得到纯净的生物柴油 实施例 以下描述只是以实例方式对优选实施方案的说明，而不意图对本发明进行限制。
实施例1. (1)种子的制备原始小球藻(Cholorella protothecoides)(购自美国Texas大学藻种中心)培养于异养培养基中作为种子，所述异养培养基包括30g L-1葡萄糖、3g L-1酵母提取物、0.7g L-1KH2PO4、0.3g L-1K2HPO4、0.3g L-1MgSO4·7H2O、0.3mg L-1FeSO4·7H2O、5g L-1甘氨酸以及0.01mg L-1维生素B1。
(2)甘蔗汁酶解液的获得使用市售家用甘蔗榨汁机获取甘蔗汁(型号YZ28，品牌恒联)，该设备内部具有液压装置，将碾轧、榨取和收集操作一体化，直接通过强大的压力将甘蔗汁榨压出来。
将从市场上购买新鲜甘蔗榨取出甘蔗汁来并且收集于器皿当中。温室下，向甘蔗汁中加入蔗糖转化酶(商品名Validase
Invertase ANL)，酶加入的量为每100kg底物300g酶，反应时间30分钟。反应结束后，本发明按照DNS法测量酶解液，其中还原糖的浓度为188-210g L-1左右(相同条件下重复3次所得范围)。
(3).制备培养基将步骤(2)中获得的酶解液用水稀释至还原糖浓度约为30g L-1左右，分装于1L摇瓶中，121℃下蒸汽灭菌30分钟，作为供小球藻生长的培养基。
(4).小球藻的摇瓶培养将步骤(1)中制备的种子接种至灭菌的培养基中，接种量优选使细胞初始密度达到3g L-1左右。在28摄氏度，在恒温摇床中培养小球藻，摇床旋转速度220rpm，培养时使培养基的pH保持在6.3±0.5之间。培养期间，每24小时平行取样3次进行测定，取平均值以定时监测细胞密度、可发酵碳源浓度以及细胞内油脂的积累随时间的变化，使用DNS法来测量培养基中还原糖的浓度。使用尼罗红染色法来评价油脂在藻细胞中的积累情况。培养基中可发酵碳源初始浓度约29g L-1可发酵碳源，培养结束时，可发酵碳源浓度约0.5g L-1，同时细胞密度达到约14g L-1。由尼罗红染色分析可见，在中性脂染色区域出现信号(图2B)，表明中性脂在培养过程中得以积累。
(5).油脂的获得将发酵液在8000g的速度下离心2min，收集细胞并进行冷冻干燥。使用石英砂机械研磨对干燥的细胞进行研磨破碎，以1:10(重量:体积)的比例向细胞中加入正己烷，振荡混匀。抽提15分钟左右。离心获得含有油脂的正己烷抽提液，优选将所述抽提液利用旋转蒸发的方法将油脂和正己烷分离开，收集油脂并称重，以油脂净重除以细胞干重，得细胞干重的油脂含量为细胞干重的50％左右(w/w)。
(6).生物柴油的制备:酯化反应由浓硫酸催化完成。将藻油置于烧瓶中，加入等摩尔量的浓硫酸作为催化剂，加入甲醇溶剂，使醇油摩尔比达到30:1，反应在55℃的恒温摇床中进行，转速约160rpm，反应48h。反应结束后，混合反应体系分成上下两层，分离位于上层的生物柴油，并置于30℃的温水中淋洗，旋转蒸发，去除溶剂，得到纯净的生物柴油。
实施例2 以与实施例1相同的方法进行实验，除了将小球藻的摇瓶培养用以下发酵实验代替之外 小球藻的5L发酵实验准备5L发酵罐(MINIFORS，瑞士)，组装好温度、pH、溶氧电极和消泡电极，加入步骤3中所述的3L异养培养基，蒸汽灭菌后冷却备用。异养发酵条件设定如下温度28±1℃，通气速率180L/h左右，pH值6.3±0.5，搅拌速度为350±50rpm；在线监测发酵罐中的溶氧变化，使其保持在10-40％饱和度范围内；当碳源消耗时，将实施例2中所述浓缩酶解液(为了便于操作，优选经冷冻干燥法将酶解液浓缩到还原糖浓度为500g/L左右)流加至发酵罐中，使还原糖浓度控制在10-30g/L范围内。监控发酵罐中溶氧、葡萄糖、细胞浓度的变化，并同时采用尼罗红荧光检测技术检测藻细胞中的中性脂肪含量(具体检测步骤参见参考文献“Danielle E，David J，BarryR，et al.Fluorescent measurement of microalgal neutrallipids.Journal of Microbiological Methods.2007.68(3):639-642)。发酵过程中细胞密度通过定时测定光密度值(OD540nm)来估算。OD540nm与细胞干重的线性关系可以用以下公式表示y＝0.4155x，(R2＝0.9933，P<0.05)，其中y表示细胞密度(g.L-1)，x表示540nm处光吸收密度值。发酵完成后，从发酵液离心收集细胞，并真空干燥称重，3L发酵液中共得到280g干藻粉(图3)。
实施例3-7 以与实施例1相同的方法进行实验，除了将摇瓶中起始还原糖浓度分别配置成5g L-1，10g L-1，15g L-1，25g L-1，30g L-1之外。从图7可见，在75小时的培养时间内，小球藻在不同碳源浓度范围内均可以生长，表现出一定的承受能力。
实施例8 以与实施例1相同的方法进行实验，除了酶解时酶的加入量为每100kg底物130g酶，培养时培养温度控制在10-20摄氏度，摇床转速控制在100-150rpm，pH控制在5.0-6.0之外。
实施例9 以与实施例1相同的方法进行实验，除了酶解时酶的加入量为每100kg底物400g酶，培养时培养温度控制在30-40摄氏度，摇床转速控制在250-300rpm，pH控制在7.0-7.5之外。
实施例10 以与实施例2相同的方法进行实验，除了发酵罐培养时培养温度控制在10-20摄氏度，搅拌速度控制在100-200rpm，pH控制在5.0-6.0，溶解氧浓度维持在5-20％之外。
实施例11 以与实施例2相同的方法进行实验，除了发酵罐培养时培养温度控制在30-40摄氏度，搅拌速度控制在400-500rpm，pH控制在7.0-7.5，溶解氧浓度维持在30-50％之外。
比较例 除了分别用按照表1配制的培养基培养小球藻之外，以与实施例1相同的方式进行实验，表1中的甘蔗汁酶解液(未补加其他营养因子)为实施例1所用的甘蔗汁酶解液。
表1
A5微量元素母液H3BO32.86g L-1，NaMo O4·2H2O 0.039g L-1，ZnSO4·7H2O 0.222g L-1，MnCl2·4H2O 1.81g L-1，CuSO4·5H2O0.074g L-1。
从表1中可见，葡萄糖对照培养基(现有技术)的配制繁杂，均需使用纯品试剂，成本较高，而本发明甘蔗汁酶解液不需添加任何其他物质，酶解后灭菌直接就可以利用。
在各培养结束后，测量利用不同培养基培养小球藻的各项指标，结果示于表2。
表2.不同碳源用于培养小球藻的各项指标比较
此外，从图4可见在两种不同培养环境下小球藻的生长曲线表现一致，对于可利用的碳源消耗动力学也是相当的，无显著差别。因此甘蔗汁酶解液中的还原性碳源完全可以取代葡萄糖作为碳源。
从图5可见在培养的前两天之内小球藻在甘蔗汁酶解液(未补加其他营养因子)中生长更快，对碳源的利用更多。虽然最高细胞密度低于在甘蔗汁完全培养基中的细胞密度，但是从每日的碳源-油脂转化速度来看是相当的(表2)。
从图6可见和原有技术中利用葡萄糖的方案进行比较，小球藻可以利用甘蔗汁中的可利用碳源，并在细胞内积累油脂。
<最终产品的评价> 生物柴油的成分测定方法如下利用气相色谱-质谱技术分析制备得到的生物柴油中成分的含量。采用DSQ GC(Thermo，USA，VARIAN VF-5ms毛细管柱30M×0.25MM)气相色谱-质谱串联仪进行分析，仪器采集的数据通过数据库搜索可以得到生物柴油中各成分的具体名称和相对含量，气相色谱-质谱分析方法是本领域技术人员公知的。表3中列出了实施例1-2和比较例中以甘蔗汁酶解液和葡萄糖为原料制备得到的生物柴油中各种脂肪酸甲酯的相对含量。
表3.生物柴油中各种脂肪酸甲酯的相对含量
从表3可见，甘蔗汁酶解液和葡萄糖作为原料而生产的油脂可供用于制备生物柴油，而且在相同的制备条件下，十六碳烯酸甲酯(C17H34O2)、9，12-棕榈酸甲酯(C19H34O2)和9-十八碳烯酸甲酯(C19H36O2)是制备所得生物柴油的主要成分，这三种物质构成了生物柴油90％以上的组成，因此认为由甘蔗作为原料所得的脂肪酸甲酯的主要成分和葡萄糖作为原料所得的结果是一致的；此外由于柴油理化性质主要取决于其主要成分，因此这还表明柴油理化性质的相同或相近似。
综上所述，以上结果表明甘蔗汁酶解液可以无需添加其他营养因子即直接用于培养小球藻，不仅简化了培养过程，还降低了生产成本。这对于大规模的生物量生产以及油脂的生产而言，都是极为有利的。
应当知晓，此处描述的具体实施方案仅仅是说明目的的，本领域技术人员针对其提出的各种改进或变化也应该落入本申请的精神和权限内。还应理解所述数值是大约值，是为了说明而提供的。
所有此处涉及或参考的专利、专利申请以及公开通过参考全部并入此处，包括所有的图和表。
权利要求
1.以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)从甘蔗提取甘蔗汁；
(2)将甘蔗汁中的多糖进行降解，使其中的碳源转化成适于产油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液；
(3)利用甘蔗汁降解液培养产油微藻；
(4)从产油微藻获得油脂；
(5)从油脂制备生物柴油。
2.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的转化方法为酸法降解、碱法降解或酶法降解，优选酶法降解。
3.根据权利要求2所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述的酶法降解为利用蔗糖转化酶进行。
4.根据权利要求2或3所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述酶的加入量为每100kg底物130-400g酶，优选每100kg底物300g酶，反应时间30分钟。
5.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述的产油微藻为小球藻。
6.根据权利要求5所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述的小球藻为原始小球藻(Cholorellaprotothecoides)。
7.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中培养产油微藻的方法为使用三角摇瓶培养，培养温度为10-40摄氏度，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度；摇床旋转速度为100-300rpm，优选150-250rpm，最优选220rpm；pH为5.0-7.5，优选6.0-7.0，更优选6.3，可发酵碳源浓度为10-30g/L，优选30g/L。
8.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中培养产油微藻的方法为使用发酵罐培养，培养温度为10-40摄氏度，优选20-30摄氏度，最优选28摄氏度；搅拌速度为100-500rpm，优选200-400rpm，最优选350rpm；pH为5.0-7.5，优选6.0-7.0，更优选6.3；溶解氧饱和度维持在5-50％，优选10-40％，可发酵碳源浓度为10-30g/L，优选30g/L。
9.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述步骤(4)从产油微藻获得油脂的方法为压榨法、裂解法、有机溶剂抽提、破碎细胞或超临界流体技术。
10.根据权利要求1所述的以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中采用酯化反应从油脂制备生物柴油。
全文摘要
以甘蔗作为原料生产生物柴油的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)从甘蔗提取甘蔗汁；(2)将甘蔗汁中的多糖进行降解，使其中的碳源转化成适于产油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液；(3)利用甘蔗汁降解液培养产油微藻；(4)从产油微藻获得油脂；(5)从油脂制备生物柴油。采用本发明方法，在将甘蔗汁中多糖转化成单糖，获得甘蔗汁降解液后，无需添加其它营养因子即可直接用于培养小球藻，不仅简化培养过程，还降低生产成本。这对于大规模的生物量生产以及油脂的生产而言，都是极为有利的。
文档编号C10G3/00GK101475823SQ20091000046
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者吴庆余, 云 程 申请人:清华大学