专利名称：用于可替宁快速检测的微流控芯片及其制备方法
用于可替宁快速检测的微流控芯片及其制备方法技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测可替宁 (cotinine)的微流控芯片，并提供了该芯片的制备方法。
背景技术：
吸烟危害健康，国内外已有众多报道研究了香烟中各种成分对于人体的危害，并 发展成为公共健康问题。各国政府对吸烟及二手烟的暴露所引起的个人和社会问题都给予 充分关注和巨大的经济投入，烟气中有害成分的快速检测，对于烟草产品的开发，人类健康 和环境保护等都有着重要的现实意义。
尼古丁(1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，俗名烟碱，英文名是nicotine，简称Nic， 分子式为C10H14N2)。是香烟中的主要毒物之一，遍布烟草全株而富集于烟叶。我国产的 烟叶尼古丁含量一般为 4%，有些引进品种高达10% 12%。尼古丁常温下为无色 或浅黄色油状液体，在空气中易变深色，极易溶于水和酒精，味辛辣，易挥发并具有强烈的 烟草味。尼古丁剧毒，可用作杀虫剂和兽用驱虫剂；它对心血管和呼吸系统有直接的毒害作 用，可引起呼吸加快、血压升高、心跳加快、甚至心律不齐并诱发心脏病；它还会破坏体内吸 收的维生素c，从而减弱人体的免疫能力。尼古丁极易被口腔、消化道和呼吸道吸收，也可 通过皮肤进入体内，摄入少量可促使体内释放肾上腺素和去甲肾上腺素及儿茶酚胺等体内 物质，使中枢神经兴奋，量多时能抑制中枢神经系统，使心脏麻痹乃至死亡。成人致死量为 40 75mg (约相当于2包香烟尼古丁总量)，儿童致死量约为10 20mg。不会吸烟的人， 抽一支烟后就会觉的头痛、恶心、心跳加快、面色苍白，这就是尼古丁中毒。吸烟时，约25% 的尼古丁被破坏，50%扩散到空间，5%残留在烟头内，只有约20%的尼古丁真正被吸烟者 吸人体内。尼古丁在空气中与人体内都会发生变化，可替宁(cotinine)是尼古丁在空气和 人体中最主要氧化产物，且化学性质稳定，半衰期较长，大于10小时，而尼古丁在空气中半 衰期较短，不易定量测定，不能作为有效测定烟气成分的标志物。所以，目前较多的选用可 替宁作为烟气暴露的特异性和敏感性标志物，其含量的检测间接反应尼古丁的含量。目前 已有商品化的检测唾液中可替宁含量的ELISA试剂盒。
目前，对于烟气中各种有害成分的检测分析，主要是传统的分析化学方法，通过薄 层色谱，气相色谱等方法进行研究。气相色谱等方法周期长，成本高，并且对工作人员有较 高的要求，由于仪器体积偏大，价格昂贵，难以做到实时在线监测。而薄层色谱等方法灵敏 度，稳定性等方面在很多情况下，又难以达到实验要求。以上传统检测方法都涉及昂贵、精 细的实验设备，具有专业技术的实验人员和实验场所，因此对于烟气成分中有害成分的快 速检测分析，需要有新技术来实现快速，灵敏，高通量的检测需求。
迄今为止国内外尚无实用的代表性烟气中有害成分的快速检测系统。未来的技术 发展主要集中在检测仪器的多功能化和微型化上。当前的烟气有害成分检测的发展趋势 是(1)连续分析来达到监控的目的；( 快速分析来达到在线检测和预警；(3)高度自动 化来完成在各种环境的普及；(4)便携性来适应快速布置的需要。
仪器的微型化集中在微流体芯片在环境分析的应用方面。该技术在化学、生物、生 物医学工程尤其在生物分析方面有着广泛的应用。以微流体芯片为基础的微型传感器或者 分析仪器是未来环境分析的发展趋势。
20世纪90年代发展起来的微流体学科是指操作微小网络通道(5-500微米)中流 体的科学技术。是分子生物学技术、微加工技术、机械制造技术、计算机技术等多种现代技 术的发展与融合。是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，具有信息通量大、 自动化、系统化的特点。微流体芯片用于操作，传输微升(10-6L)至毫微微升(10-15L)量 级的流体。可将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在一块或几块微流体芯片 上，其微通道孔径只有微米级大小，具有浓缩和富集的作用，可以加速反应缩短测试时间， 从而大大降低了测试成本。和常规的实验技术相比，该技术极大降低了试剂的消耗量(至 少3个数量级)、同时分析产生的废液极少。在微小范围内的能量传递、物质分散更快更均 勻，热能传导快，也更易实现各种操控，因此反应快、收率高，污染少、成本低。新一代的微流 体芯片由高分子材料，例如硅酮polydimethylsiloxane (PDMS)，制成(见附图1)，材料造价 低廉(少于10美金/片)，制造周期短(少于M小时)，所需设备为少数常规设备，不需要 大型机密仪器，适合于大规模生产，可用于生产一次性使用产品。该技术的发展的趋势是芯 片实验室，即可将整个生化实验室功能集成在一块芯片上完成。
另外，由于PDMS材料的物理弹性，多种功能性模块，例如微阀门，流体泵以及流体 混合器，都可以集成到微流体芯片中。而这些微阀门，流体泵等功能模块的可通过计算机编 程控制。这样的集成化、数控式微流体芯片，便可以完成一些复杂的操作。例如分离，进样， 清洗，色谱柱分离鉴定等化学或生物分析操作。以微流体芯片为基础的仪器例如PCR，蛋白 结晶仪，DNA测试仪都已经被设计制造出来。同常规方式相比，它的主要特点是
1)低价，因为使用的试剂的量极其微量，完成测试需要的费用极低；
2)高效，在微流体芯片中反应速度快，传热传质效率高，测试速度快；
3)应用模版技术制造，适用于大规模生产；
4)容易集成，不同目标的测试模块可方便的集成到一块芯片中，完成多目标并行 分析；
5)自动化程度高，它可以很方便和现代电子技术结合，不仅使芯片分析测试自动， 而且信号传输以及信号自动分析也可以自动完成。
6)兼容性好，其他的微分析技术，例如微电极技术，生物传感器技术也可以整合到 微流体芯片技术中。发明内容
本发明的目的在于提供一种用于对可替宁(cotinine)快速检测的微流控芯片。 该芯片同现行的检测技术相比具有高效、低价、便携和自动化的特点。
本发明提供的包括对实际样品中cotinine进行快速检测的微流控芯片，以光学 透明材料为基材，主要由样品通道层，阀门控制层及基片层构成；其中，样品通道层内含样 品富集及免疫分析模块；该样品富集及免疫分析模块由一个或几个并联或串联的纳升体积 的免疫色谱柱微分析室所组成。每个分析室连接有多个进样口和出样口，每个微分析室通 过聚合填料键合固定有可替宁抗体蛋白，能够和样品混合物中的cotinine发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的抗原实现，经过多次洗涤之后，免疫标记信号的产生的变化 如荧光强度的变化可以被信号采集模块采集分析；信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器 件阵列组成，抗体可替宁间的特异性结合导致的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传至 到微处理器(计算机)中和数据库相比较，来分析样品所含成分的浓度。
本发明用于现场生物检测分析的免疫微流控芯片的光学透明材料选自无机材料: 石英、玻璃，硬质高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对本二甲酸乙二醇脂、聚 苯乙烯、聚丙烯，弹性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料为硅片。
本发明中样品通道层中有免疫色谱柱微分析室。阀门控制层含有气压控制阀门， 控制样品通道层相关孔道的开关。阀门控制层的阀门通过气压或电子元件控制，阀门通道 的直径为1 30 μ m。
本发明微流控芯片的免疫色谱柱微分析室为整体柱或聚合填料灌柱，聚合填料为 硅胶填料或其它有机聚合物。
本发明微流控芯片的微分析室中可根据检测目的的不同，灌注已键合或可以键合 不同抗原或抗体的填料。
本发明的免疫色谱柱微分析室的个数可由实际情况确定，如样品数及其中各成分 的性质差别，在本发明的具体实施中制备了一个单样品的微流控芯片，可根据实际情况将 该单通道以不同方式并联、串联。
本发明的色谱柱微分析室的个数可由实际情况确定，如样品数及其中各成分的性 质差别，在本发明的具体实施中制备了一个单样品的微流控芯片，可根据实际情况将该单 通道以不同方式串联。
整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体 芯片，数控界面)和数据采集，数据分析部分(计算机)。软件系统主要包括LABVIEW程序 (控制)和ImagePr0程序(数据分析)。
本发明提供了上述微流控芯片的制备方法具体如下(以负胶为例)
(1)基片准备将硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮气吹干，用SU-82050系列 经旋涂机甩涂，在恒温加热板上软烘；
(2)曝光和烘焙将设计好的样品通道层，阀门控制层的硅片模板分别放置在甩 涂好的基片上，应用紫外曝光机曝光，之后在加热板上烘焙；
(3)显影将硅片放入显影液中显影，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并 用氮气吹干；
(4)硬烘在热板上缓慢加热固定；
(5)浇注PDMS (聚二甲基硅氧烷)单体及固化剂按质量配比5 1至20 1混 合均勻，分别倒在相应的硅片模具上，在烘箱内固化，剥离；
(6)键合将两层PDMS芯片校准键合形成微通道腔，再与基片层键合。
图1 一种用于cotonine的快速检测微流控芯片的设计图。
图2 —种用于cotonine的快速检测微流控芯片的具体实施示意图。
图中标号1气阀气体入口，2样品入口，3气阀气体通道，4样品通道，5填料进/出口，6微分析室，7样品出口。
具体实施方式
基片准备。将硅片放入Piranha溶液(98%浓硫酸30%双氧水=7 3)煮沸 清洗15min。用去离子水冲洗5遍后用氮气吹干，并在200°C烘焙30min.
甩涂。将Microchem公司的SU_8胶(下同)倒在硅片中央，倾斜硅片边缘，使 SU-8覆盖住硅片大部分区域。静置15min，同时消除掉倾倒过程中产生的气泡。用旋涂机 (Spin-Coater KW-4A, Chemat Technology, Inc.)进行两次递进式甩涂500 转/min 旋涂 25s，3000转/min旋涂50s，使胶分布较为均勻，静置IOmin缓解边缘突起效应。
软烘。在热板上以5°C /min的速率逐步升到95°C，期间在65°C、95°C和65°C的条 件下，分别保持3min、6min和3min。
曝光。采用接触式曝光机(波长365nm)，这是因为SU-8胶在365nm的紫外光波段 吸收少，可以获得很好的曝光一致。
曝光后烘焙。再热板上以5°C /min的速率由室温逐步升到95°C，期间在65°C和 95°C分别保持Imin和5min。之后以0. 5°C /min的速率缓慢降至室温。
显影在通风橱中进行，显影液的主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)。在SU_8 模具与显影液分别静置达到室温后，将模具放入显影液中显影7min，之后分别用异丙醇和 去离子水清洗干净，并用氮气吹干。
硬烘。在热板上180°C保温5min，再于200°C保温25min，再缓慢降至室温。
浇注聚二甲基硅氧烷(PDMQ聚合物成型。将把采用光刻法制作的微通道PDMS印 章分别用丙酮、无水乙醇分别超声5min，清除通道印章上的水分，把清洗好的印章60°C烘 箱烘烤4h。PDMS单体与固化剂按照5 1的质量配比混合均勻，除净气泡。倒在经三甲基 氯硅烷处理过的SU-8模具上，在调整好的水平热板上80°C保持池固化。形成上层具有反 应微通道层的基片。
具有控制通道的PDMS层制作。在硅片上甩涂光刻胶，经紫外曝光、显影，制成硅基 光阳模，并于120°C退火30min，使光刻胶软化，硅基光胶阳模用三甲基氯硅烷在气相中处 理7min，使其表面硅烷化，以防止在注塑过程中PDMS的粘附。并且具有控制通道的PDMS层 单体与固化剂的比例为20 1，相对较软。在甩胶机上2000转/min甩涂35s。形成下层 具有控制阀门通道的基片。
键合及接口制作。将上层基片打孔，下层基片打孔用于控制通道。上下两片仔细 对合，80°C过夜固化，与玻璃盖片热键和。
单个免疫微分析室的体积为180 μ mX 30 μ mX 2 μ m。
若免疫微分析室色谱柱为聚合材料填充柱，可经图一三个进样通道中任一个将已 吸附抗体的聚合材料填料灌注装柱，闭合柱底阀门，控制阀门气压不超过20psi，同时控制 装柱速度，待填料装满后进缓冲液平衡色谱柱，实际样品(烟气吸收溶液或尿液，唾液等) 溶液、特异性抗体及标记竞争物经图一中任一进样孔进入色谱柱，温育10-20分钟，进洗涤 缓冲液洗去过量的抗体及标记竞争物，加入显色缓冲液显色，抗体/continine间的特异性 结合导致的光学信号都可被信号采集模块的光敏器件阵列采集并传至到微处理器(计算 机)中和数据库相比较，来分析样品所含成分的浓度。
整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体 芯片，数控界面)和数据采集，数据分析部分(计算机)。软件系统主要包括LABVIEW程序 (控制)和ImagePro程序(数据分析)如图2所示。
权利要求
1.一种应用于快速检测可替宁的微流控芯片，其特征在于该芯片以光学透明材料为基 材，主要由样品通道层，阀门控制层及基片层构成；其中，样品通道层内含样品富集及免疫 分析模块；该样品富集免疫分析模块由一个，或几个并联或串联的纳升体积的免疫色谱柱 微分析室组成，每个分析室通过聚合填料键合固定有可替宁抗体蛋白或抗原，以便发生免 疫反应；阀门控制层含有气压控制阀门，控制样品通道层相关孔道的开关。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述光学透明材料选自无机材料 石英、玻璃，硬质高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对本二甲酸乙二醇脂、聚 苯乙烯、聚丙烯，弹性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料为硅片。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫色谱柱为整体柱或聚合填料灌 柱，聚合填料为硅胶填料或其它有机聚合物。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫分析模块的键合物为二抗或抗 原，免疫分析信号由标记的反应物实现，标记物为各种染料或荧光。
5.一种如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于采用模塑法，具体步 骤如下(1)基片准备将硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮气吹干，用SU-82050系列经旋 涂机甩涂，在恒温加热板上软烘；(2)曝光和烘焙将设计好的样品通道层，阀门控制层的硅片模板分别放置在甩涂好 的基片上，应用紫外曝光机曝光，之后在加热板上烘焙；(3)显影将硅片放入显影液中显影，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮 气吹干；(4)硬烘在热板上缓慢加热固定；(5)浇注聚二甲基硅氧烷单体及固化剂按质量配比5 1至20 1混合均勻，分别 倒在相应的硅片模具上，在烘箱内固化，剥离；(6)键合将两层聚二甲基硅氧烷芯片校准键合形成微通道腔，再与基片层键合。
6.如权利要求1所述微流控芯片在分析检测可替宁中的应用，其特征在于具体步骤如下样品溶液由所述微流控芯片的进样口进入芯片，芯片微分析室中的可替宁抗体蛋白 或抗原与样品中的可替宁发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的抗原实现，经过多 次洗涤之后，免疫标记信号的产生的变化被信号采集模块采集分析；信号采集模块由紫外 LED和荧光光敏器件阵列组成，抗体可替宁间的特异性结合导致的光学信号被光敏器件阵 列采集并传至到微处理器中和数据库相比较，来分析样品所含成分的浓度。
全文摘要
本发明属生物分析检测技术领域，具体为一种可替宁快速检测的微流控芯片及其制备方法。该芯片采用模塑法以光学透明的聚二甲基硅氧烷等为材料，主要由样品反应微通道层，阀门控制层及基片层构成。芯片内含样品富集及免疫分析模块和信号采集模块，该模块由并行的几个纳升体积的免疫色谱柱微分析室组成，每个分析室固定了可替宁抗体蛋白或抗原，实现了对不同来源的样品中可替宁的快速检测。本发明具有快速、高效、便携低价和易自动化控制的特点，可完成自动信号采集、远程传输和信号分析，适合于空气中该成分的快速检测及医学临床检测。
文档编号G01N30/56GK102033127SQ200910247558
公开日2011年4月27日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者刘思秀, 刘超, 张金玲, 赵望, 隋国栋 申请人:复旦大学