专利名称：基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法
技术领域：
一种基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，属于材料化学技术领域。
背景技术：
纳米材料的自组装是纳米技术的一个研究热点，原因在于自组装纳米材料能够表现出不同于单分散的纳米粒子的独特的光学、电学、磁学和化学性质，通过研究自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。链状组装体在光电和生物传感器设备上有很大的应用前景，一般的组装方法为模板法或者分子连接法，但后期的物理或化学处理对粒径间的间距以及组装体的空间排布有不可预计的影响。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction),是分子生物学中应用的基础实验手段，是上世纪80年代中期发展起来的一种体外特定核酸序列扩增技术。它具有特异性强、扩增效率高、快速、简便、重复性好、易实现自动化等优点。纳米技术与生物技术相结合产生的纳米生物技术凭借其独特的性质得到了广泛的研究发展，被越来越多的科研人士所青睐。而金纳米粒子，由于其独特的物理、化学性质及生物相容性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域都有很广泛的应用。将纳米材料结合到PCR过程中已成为近年来的研究热点，对于提高PCR的特异性和效率和组装结构手性性质的研究有很大的作用。本发明首次通过PCR方法进行了大金和小金的链状可控组装，并首先对链的手性性质进行了研究和探讨。圆二色谱(CD)的原理是由不对称分子组成的物质是光学各向异性的，物质对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象称为圆二色性。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。可以用圆二色谱研究某些立体结构，对PCR组装后不同长度链状结构体的手性进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于聚合酶链反应的大金和小金的链状可控组装，并对组装产物的手性性质进行研究。本发明的技术方案:基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物的手性研究方法，包括大金纳米粒子和小金纳米粒子的合成，其表面的引物修饰，金纳米粒子-引物偶联物的稳定修饰，不同长度的链状可控组装，组装产物的手性性质表征。具体步骤:(I) 25nm金纳米粒子合成采用朽1檬酸三钠还原氯金酸合成25nm金纳米粒子。(2) IOnm金纳米粒子合成采用单宁酸还原氯金酸合成IOnm金纳米粒子。(3)金纳米粒子和引物的偶联
将新合成的25nm金纳米粒子和巯基修饰的上游引物F-primer偶联，新合成的IOnm金纳米粒子和巯基修饰的下游引物R-primer偶联,分别形成金纳米粒子_引物偶联物。F-primer (50bp):5，-SH-(CH2) 6-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG_3，，R-primer (50bp):5’ -SH-(CH2) 6-GGGCCATGATTACGCCAGTT_3’。(4)金纳米粒子-引物偶联物的稳定将金纳米粒子-引物偶联物和巯基修饰的聚乙二醇(PEGicicici)反应，以达到稳定金纳米粒子的作用。(5)链状可控组装以λ DNA为模板，通过优化PCR扩增条件，将金纳米粒子-引物偶联物在PCR体系中进行不同循环数下的组装，离心浓缩，得组装产物。(6)组装产物的TEM和手性性质表征组装产物进行TEM和⑶表征。所述不同粒径金纳米粒子合成:25nm金纳米粒子合成:将47.5mL的超纯水加入到洁净的三角烧瓶中，搅拌条件下加入2.5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热搅拌，达沸腾，紧接着加入0.9mLl%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡紫色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；溶液冷却至4°C保藏，即制得粒径为25nm的金纳米粒子；IOnm金纳米粒 子合成:配制lmLl%的氯金酸于79mL的超纯水中，混合均匀即为A溶液；将4mLl%柠檬酸三钠溶液、0.lmLl%的单宁酸溶液和0.1mL浓度为25mM的碳酸钾混于15.8mL的超纯水中，即为B溶液；将A和B溶液分别加热到60°C，在高速搅拌下把B溶液迅速加到A溶液中，反应液在60°C下继续搅拌反应，然后溶液加热回流2min，形成亮红色的溶液，最终冷却至室温合成粒径在IOnm的金纳米粒子。所述金纳米粒子和引物的偶联:( i )将步骤(2)中制备好的lmL2nM25nm金纳米粒子及ImLlOnMlOnm金纳米粒子分别以7000rpm、13000rpm离心lOmin，弃上清，分别重悬在100 μ L的超纯水中，4°C保藏、待用；(ii) 25nm金纳米粒子和上游引物F-primer偶联:取(i )制备好的50 μ L25nm金纳米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混匀，室温反应12h ；(iii) IOnm金纳米粒子和下游引物R-primer偶联:取(i )制备好的50 μ LlOnm金纳米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer，混匀，室温反应12h ；(iv)将上述(ii )和(iii)步骤中反应溶液分别在7000rpm、13000rpm离心lOmin,弃
上清，后用50 μ L的超纯水分散沉淀，4°C保藏、待用；所述金纳米粒子-引物偶联物的稳定:将步骤(3)中的金纳米粒子-引物偶联物中加入2μ LlOOyM的PEGicicici，反应12h，反应后的溶液在8000rpm离心lOmin，弃上清，后用50 μ L的超纯水分散沉淀，4°C保藏、待用。所述链状可控组装:(a)PCR:以λ DNA为模板,采用制得的25nm金纳米粒子-F-Primer及IOnm金纳米粒子-R-Primer 进行 PCR，PCR 反应体系:dNTPsl μ L，0.5 μ L 的 Taq DNA 聚合酶，λ DNA 模板质粒0.5 μ L, PCR反应缓冲液5 μ L,分别取25nm金纳米粒子-F_Primer4 μ L和IOnm金纳米粒子-R_Primer4y L,加灭菌水至总体积为50μ L ；(b)扩增程序为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，2 20个循环；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR产物。所述组装产物的TEM和手性性质表征:取500 μ L PCR产物进行8000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用100 μ L的超纯水分
散，进行TEM和⑶表征。其中:dNTPs (购自上海生工)，Taq DNA聚合酶(购自上海生工)，λ DNA模板质粒(购自宝成生物工程有限公司)，PCR反应缓冲液(购自上海生工)。表I模板、上下游引物和模板序列及长度
权利要求
1.一种基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于包括大金纳米粒子和小金纳米粒子的合成，其表面的引物修饰，金纳米粒子-引物偶联物的稳定，不同长度的链状可控组装，组装产物的手性性质表征； 具体步骤: (1)25nm金纳米粒子合成 采用朽1檬酸三钠还原氯金酸合成25nm金纳米粒子； (2)IOnm金纳米粒子合成 采用单宁酸还原氯金酸合成IOnm金纳米粒子； (3)金纳米粒子和引物的偶联 将新合成的25nm金纳米粒子和巯基修饰的上游引物F-primer偶联,新合成的IOnm金纳米粒子和巯基修饰的下游引物R-primer偶联,分别形成金纳米粒子-引物偶联物；F-primer:5’ -SH-(CH2) 6-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG_3，，扩增长度为 50bp ；R-primer:5’ -SH-(CH2) 6-GGGCCATGATTACGCCAGTT_3’，扩增长度为 50bp ； (4)金纳米粒子-引物偶联物的稳定 将金纳米粒子-引物偶联物和巯基修饰的聚乙二醇PEG.反应，以稳定金纳米粒子； (5)链状可控组装 以λ DNA为模板，通过优化PCR扩增条件，将金纳米粒子-引物偶联物在PCR体系中进行不同循环数下的可控组装，离心浓缩，得组装产物； (6)组装产物的TEM和手性性质表征 组装产物进行TEM和⑶表征。
2.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于不同粒径金纳米粒子合成: 25nm金纳米粒子合成:将47.5mL的超纯水加入到洁净的三角烧瓶中，搅拌条件下加入2.5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热搅拌，达沸腾，紧接着加入0.9mLl%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡紫色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；溶液冷却至4°C保藏，即制得粒径为25nm的金纳米粒子； IOnm金纳米粒子合成:配制lmLl%的氯金酸于79mL的超纯水中，混合均匀即为A溶液；将4mLl%柠檬酸三钠溶液、0.lmLl%的单宁酸溶液和0.1mL浓度为25mM的碳酸钾混于15.8mL的超纯水中，即为B溶液；将A和B溶液分别加热到60°C，在高速搅拌下把B溶液迅速加到A溶液中，反应液在60°C下继续搅拌反应，然后溶液加热回流2min，形成亮红色的溶液，最终冷却至室温合成粒径在IOnm的金纳米粒子。
3.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于金纳米粒子和引物的偶联: (i )将步骤(2)中制备好的lmL2nM25nm金纳米粒子及ImLlOnMlOnm金纳米粒子分别以7000rpm、13000rpm离心lOmin，弃上清，分别重悬在100 μ L的超纯水中，4°C保藏、待用；( ) 25nm金纳米粒子和上游引物F-primer偶联:取(i )制备好的50 μ L25nm金纳米粒子加入50 μ L200nM的F-primer，混匀，室温反应12h ； (iii) IOnm金纳米粒子和下游引物R-primer偶联:取(i )制备好的50 μ LlOnm金纳米粒子加入50 μ LI μ M的R-primer ，混匀，室温反应12h ；(iv)将上述(ii )和(iii)步骤中反应溶液分别在7000rpm、13000rpm离心IOmin,弃上清，后用50 μ L的超纯水分散沉淀,4°C保藏、待用。
4.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于金纳米粒子-引物偶联物的稳定: 将步骤(3)所得的金纳米粒子-引物偶联物中加入2μ LlOOyM的PEGicitltl，室温反应12h，反应后的溶液在8000rpm离心lOmin，弃上清，后用50 μ L的超纯水分散沉淀，4°C保藏、待用。
5.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于链状可控组装: (a)PCR:以λ DNA为模板,采用制得的25nm金纳米粒子-F-Primer及IOnm金纳米粒子-R-Primer 进行 PCR，PCR 反应体系:dNTPsl μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，λ DNA 模板质粒0.5 μ L, PCR反应缓冲液5 μ L,分别取25nm金纳米粒子-F-Primer4 μ L和IOnm金纳米粒子-R_Primer4 μ L,加灭菌水 至总体积为50 μ L ; (b)扩增程序为:94°C预变性3min;94°C变性30s，60。。退火30s，72。。延伸lmin，2 20个循环；72°C再延伸IOmin ; 10°C保存，得PCR可控组装产物。
6.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，其特征在于组装产物的TEM和手性性质表征: 取500yL PCR产物进行8000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用100 μ L的超纯水分散，进行TEM和⑶表征。
全文摘要
基于聚合酶链反应的大小金链状可控组装产物手性研究的方法，属于材料化学技术领域。本发明主要内容为首先合成不同粒径25nm和10nm的金纳米粒子，通过对金纳米粒子表面引物偶联量的可控修饰，达到金纳米粒子在PCR体系中的稳定性，并对金纳米粒子-引物偶联物用PEG1000进行修饰。在合适的PCR条件下，进行大小金的链状可控组装，并对可控组装产物进行TEM表征和CD信号研究比较。本发明首次通过PCR方法进行了大金和小金的链状可控组装，并首次对不同循环数下PCR组装的不同长度链状组装产物的手性性质进行了研究和探讨。
文档编号B82Y40/00GK103212706SQ201310080609
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者王利兵, 赵媛, 胥传来, 马伟, 徐丽广, 匡华, 刘丽强, 宋珊珊, 胡拥明, 丁利 申请人:江南大学