三维硅纳米芯片及其分离检测循环肿瘤细胞的方法和用途
【专利摘要】本发明涉及三维硅纳米芯片及其分离检测循环肿瘤细胞的方法和用途，将硅片切块后放到piranha?solution中加热，然后用水洗、吹干，放入到2％的APTES溶液中浸泡2h，用无水乙醇和去离子水分别将硅片冲洗干净，浸入2.5％戊二醛溶液1h，放置入培养腔室玻片中，将浓度为10μg/ml的anti-EpCAM溶液均匀的滴在硅片上，室温下反应0.5h，用PBS洗去多余的抗体，用25μL的1％BSA溶液封闭1h制备得到所述的芯片，采用该芯片可以用于捕获外周血中的循环肿瘤细胞。本发明开发的新颖便捷的CTC捕获芯片能够对实验室癌细胞进行高效率的捕获，其相对于现有技术而言，工艺更为简单，成本更低，具有巨大的临床价值。
【专利说明】三维硅纳米芯片及其分离检测循环肿瘤细胞的方法和用途
[【技术领域】]
[0001] 本发明涉及肿瘤细胞检测设备和方法【技术领域】，具体的说是一种三维硅纳米芯片 及其分离检测循环肿瘤细胞的方法和用途。
[【背景技术】]
[0002] 恶性肿瘤细胞获得侵袭能力并造成远处转移是其致死的主要原因。血运转移是 转移的重要方式之一，肿瘤细胞从原发病灶脱落进入血液循环并侵袭其他脏器进行远处转 移，因此检测外周血中循环肿瘤细胞（CTCs)具有重要的临床意义。CTCs作为一种代表原发 肿瘤的"液态活检标本"，与原发病灶具有相似乃至相同的生物学特性。但对于数以万计的 外周血细胞而言，CTCs在外周血中含量微乎其微，大约每1 X 105?1 X 107个外周单核细胞 中才有一个CTC，可见对于外周血中肿瘤细胞的检测，具有相当大的难度。近年来，随着人 们对肿瘤转移机制的深入研究及检测技术的不断改进，CTCs检测已取得了一定的进展。因 CTCs含量稀少，细胞富集以提高检测的敏感度显得尤为重要，现常用的细胞富集技术主要 包括微流控分析芯片技术、基于表面特异性分子的免疫磁分选技术、基于细胞形态的密度 梯度离心法和细胞膜滤过法等。细胞富集结束后，通过核酸技术或细胞计数方法对CTC进 行检测和分析。
[0003] 近十年，关于循环肿瘤细胞的捕获成为人们研究的热点。基于免疫磁珠分离 的CellSearch系统，是目前唯一被美国食品与药物监督管理局（FDA)批准用于转移性 结直肠癌、乳腺癌或前列腺癌CTCs检测的新技术 [5]，但其检测费用昂贵，假阳性率较高； Nagrath[6'8]等利用微流控芯片技术对多种外周血CTCs进行检测，捕获率均> 60%，进一 步拓展了 CTC研究的思路；王树涛等利用聚苯乙烯小球辅助技术，通过硅板表面纳米纤毛 与细胞表面纳米结构（e.g.微绒毛、伪足等）的相互作用制作的三维硅板芯片对CTC也具 有较好的捕获率，但其制作工艺复杂，价格昂贵，对于临床大规模生产应用具有一定的局限 性。黑硅作为硅片离子反应刻蚀的副产物，直到1998年Mazur实验室发现其特殊生物学特 性才得以得到广泛研究。
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【发明内容】
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[0004] 本发明的主要目的在于解决现有技术中捕获CTC效率不高，其捕获成本较高的技 术缺陷，以一种通过DRIE (即深度反应离子刻蚀，Deep Reactive Ion Etding)技术，以黑娃 为基底的高效捕获CTC芯片。
[0005] 为了实现上述目的，提供一种三维硅纳米芯片，其制备方法如下：
[0006] 将黑硅进行深度反应离子刻蚀
[0007] 将硅片切块，
[0008] 将切块放到piranha solution中，在80-10CTC下加热30分钟，
[0009] 用去离子水冲洗干净、氮气吹干，
[0010] 放入到2%的APTES溶液中浸泡2h， toon] 取出后用无水乙醇和去离子水分别将硅片冲洗干净，
[0012] 浸入2. 5%戊二醛溶液lh，
[0013] 将硅片放置入培养腔室玻片中，将浓度为10 μ g/ml的anti-EpCAM溶液均匀的滴 在硅片上，室温下反应0. 5h，
[0014] 用PBS洗去多余的抗体，
[0015] 用25 μ L的1 % BSA溶液封闭lh。
[0016] 所述的piranha solution优选由98% H202按体积比3:1混合制得。
[0017] 所述的切块是优选切成2cmX 1cm大小的切块。
[0018] 其纳米线长度优选控制在5?50 μ m，更优选控制在15?50 μ m。
[0019] 本发明还包括一种分离检测循环肿瘤细胞的方法，培养外周血细胞得到细胞悬 液，外周血细胞中含有循环肿瘤细胞，之后采用上述的三维硅纳米芯片捕获所述的循环肿 瘤细胞。
[0020] 捕获的步骤进一步如下：在装有上述三维娃纳米芯片的玻片中，均勻加入lml所 述的细胞悬液；将玻片置入37°C、5% C02的培养箱中孵育45min，然后再轻轻的用PBS冲洗 5遍；将三维硅纳米芯片置入4%多聚甲醛中反应20min，再用0. 9ml的0. 2% Triton X-100 溶解lOmin增加细胞膜的通透性，促进细胞内的着色；再将三维硅纳米芯片用DAPI液反应 5min，随后用PBS清洗3遍；在荧光显微镜下观察；将三维硅纳米芯片上的细胞冲洗三遍， 用细胞计数仪计数。
[0021] 所述的细胞悬液浓度优选为105cells/ml。
[0022] 本发明还的三维硅纳米芯片可以用在循环肿瘤细胞检测设备中。
[0023] 本发明开发的新颖便捷的CTC捕获芯片能够对实验室癌细胞进行高效率的捕获， 其相对于现有技术而言，工艺更为简单，成本更低，具有巨大的临床价值。
[【专利附图】
【附图说明】]
[0024] 图1为CTC芯片癌细胞捕获流程图；
[0025] 图2为黑硅加工技术原理图；
[0026] 图3为制备的黑硅结构SEM图片；
[0027] 图4为平硅、黑硅、黑硅包被anti-EpCAM捕获率比较图；
[0028] 图5为芯片捕获细胞后在SEM扫描下的电镜图；
[0029] 图6芯片中的纳米线长度与捕获率的关系示意图。
[【具体实施方式】]
[0030] 1材料与方法
[0031] 1. 1材料RPMI1640培养液和小牛血清等均购置美国Gibco公司；APTES和戊二醛 购置美国Sigma公司；anti-EpCAM购自美国R&D公司；细胞株HCT116购自中科院上海细胞 库；培养腔室玻片（4-well Lab-TekTM Chamber Slides)购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；黑硅由上海中科院微系统与信息研究所提供。
[0032] 1. 2三维黑硅纳米阵列制作
[0033] 黑硅加工工艺是基于B0SCH的DRIE技术实现的。B0SCH工艺的原理为，在反应腔 室中轮流通入钝化气体C4F8与刻蚀气体SF6，分别跟样品产生钝化与刻蚀作用，在工艺的整 个过程中淀积钝化层步骤与刻蚀步骤的反复交替进行，使得样品被持续垂直刻蚀，刻蚀深 度可以达到百微米甚至毫微米级。具体可以用以下各步骤：1)刻蚀气体sf 6在射频电场作 用下分解，提供刻蚀所需的中性活性基团与带电离子，对Si产生刻蚀作用。2)保护气体C4F 8 在射频电场作用下分解生成碳氟聚合物保护层覆盖在已经做好图形的样品表面，形成侧墙 保护。3)刻蚀气体5匕在射频电场作用下分解，提供刻蚀所需的中性活性基团与带电离子。 通过离子轰击，去除底部的钝化层，由于离子轰击的方向性，其对侧墙保护层的刻蚀速度很 慢，一个工艺循环内侧壁的保护层不会被去除。紧接着活性基团对Si产生各项同性刻蚀作 用，由于侧墙保护层的存在，该刻蚀过程基本只发生在底部。重复步骤2)与3)，可以使得刻 蚀持续在垂直方向进行，产生非常好的各项异性效果。
[0034] 1. 3 CTC捕获芯片的制备
[0035] 将娃片切成2X 1cm大小的小块，然后放到piranha solution(3:1，98 % H2S04:30%H202)中，加热到80-100°C30分钟。用去离子水冲洗干净、氮气吹干后再放入 到2%的APTES溶液中浸泡2h，取出后用无水乙醇和去离子水分别将硅片冲洗干净，浸入 2. 5%戊二醛溶液lh。将硅片放置入2Xlcm大小的培养腔室玻片中，将anti-EpCAM溶液 (10μ g/ml)均匀的滴在硅片上，室温下反应0. 5h，然后用PBS洗去多余的抗体；用25yL的 1 % BSA溶液封闭lh，以降低其对癌细胞的非特异性吸附。制备好的CTC芯片保存在4°C的 冰箱备用。
[0036] 1. 4细胞及细胞培养
[0037] 人结直肠癌细胞株!1(：1'116用含5%小牛血清的1?^11640培养液（含10(^/1^青 霉素和100 μ g/mL链霉素）、置于37°C、5% C02的培养箱中培养。
[0038] 1. 5细胞捕获计数及荧光染色
[0039] 在装有芯片的玻片中，均匀加入lmlHCT116细胞悬液（浓度：105Cells/ml);将玻 片置入37°C、5% C02的培养箱中孵育45min，然后再轻轻的用PBS冲洗5遍；将芯片置入 4%多聚甲醛中反应20min，再用0. 9ml的0. 2% Triton X-100溶解lOmin增加细胞膜的通 透性，促进细胞内的着色；再将芯片用DAPI液反应5min，随后用PBS清洗3遍；在荧光显微 镜下观察；将芯片上的细胞冲洗三遍，用细胞计数仪计数。
[0040] CTC芯片的制备与癌细胞的捕获全过程见图1，简单，可操作性强.利用黑硅进 DRIE刻蚀又被称之为"底部长草"，主要原因为刻蚀与钝化的失调导致，一个成功的BOSCH 工艺需要在每个工艺循环中刻蚀过程大于钝化方面，在刻蚀顺利进行的同时保证在底部没 有未去掉的钝化层。如果底部存在未去除的钝化层将导致钝化层下部分的硅无法被刻蚀， 从而形成类似草状硅柱，这些草状硅柱在刻蚀沟槽的底部反光程度较差，呈深色，所以被称 为黑硅现象。当将黑硅作为制作目标时，可利用这种失调，降低刻蚀时间，增加钝化时间，直 接在硅片的暴露表面进行深硅刻蚀（图2)，可以直接得到三维硅纳米线结构硅片。
[0041] 我们利用DRIE刻蚀工艺，在（100)硅片表面制备了垂直方向排布的三维纳米线阵 列结构，对于芯片硅纳米线的长度可控制在5-50 μ m之间（图3)。为了测试芯片的捕获 率，我们分别在平硅、黑硅、黑硅搭载抗体三种不同硅片上滴加lml浓度为105cell S/ml的 HCT116细胞悬液，进行细胞捕获实验。我们发现黑硅包被抗体较另外2种硅片能显著提高 细胞捕获效率（图4)，不仅证明了 CTC芯片捕获的高效性，而且通过包被抗体与不包被抗体 的对照研究，进一步证明了 CTC芯片捕获的特异性。捕获的细胞通过2. 5%戊二醛溶液及 2%四氧化锇溶液固定，脱水后在SEM扫描电镜下观察发现，捕获细胞通过伸出表面伪足与 基底纳米结构密切作用从而实现细胞的捕获（图5)。
[0042] 在实验过程中，我们发现随着癌细胞与芯片孵育时间的增加，细胞捕获率也随之 增加，为了找到最少的时间点从而得到最大捕获率，我们设计了反应15、30、45、60min的 效率差异实验。从中我们发现孵育45min后CTC捕获效率基本不再升高，最高捕获率达到 83%，较151^11时提高60 (%捕获率，因而我们后面的孵育时间均设定为451^11(图6)。另外 我们通过比较不同纳米线长度（0、5、10、15、20、25μπι)捕获率发现，细胞捕获率随着纳米 线长度升高而呈现上升趋势，在长度为15 μ m后捕获率基本不再上升，证明纳米线长度与 细胞捕获率存在紧密关系，且最佳捕获长度为15 μ m，提示可能纳米线长度变化从而引起硅 片表面结构变化，从而与细胞表面纳米结构形成更好的反应作用。
[0043] 经过上述本实验研究可知，本发明开发的新颖便捷的CTC捕获芯片对实验室癌细 胞捕获的高效率已得到实验证实。这是一种基于黑硅为实验材料，通过DRIE刻蚀技术而制 作的三维纳米芯片，通过表面搭载anti-EpCAM从而实现细胞的捕获。虽然现在还只是初步 研究，但通过对癌细胞的高捕获率可以预见随着研究的深入及临床试验的开展，必将有巨 大的临床价值，尤其是早期肿瘤的排除和诊断及提供诊断性化疗的细胞分子生物学依据。
【权利要求】
1. 一种三维硅纳米芯片的制备方法，包括将黑硅进行深度反应离子刻蚀的步骤，其特 征在于还包括一下步骤： 将硅片切块， 将切块放到piranha solution中，在80_100°C下加热30分钟， 用去离子水冲洗干净、氮气吹干， 放入到2%的APTES溶液中浸泡2h， 取出后用无水乙醇和去离子水分别将硅片冲洗干净， 浸入2. 5 %戊二醛溶液lh， 将硅片放置入培养腔室玻片中，将浓度为l〇yg/ml的anti-EpCAM溶液均匀的滴在硅 片上，室温下反应0. 5h， 用PBS洗去多余的抗体， 用25 μ L的1 % BSA溶液封闭lh。
2. 如权利要求1所述的三维娃纳米芯片的制备方法，其特征在于所述的piranha solution 由 98% 1^04:301% H202 按体积比 3:1 混合制得。
3. 如权利要求1所述的三维硅纳米芯片的制备方法，其特征在于所述的切块是切成 2cmX lcm大小的切块。
4. 一种权利要求1方法制备的三维硅纳米芯片。
5. 如权利要求4所述的三维硅纳米芯片，其特征在于其纳米线长度控制在5?50 μ m。
6. 如权利要求4所述的三维硅纳米芯片，其特征在于其纳米线长度控制在15? 50 μ m〇
7. -种分离检测循环肿瘤细胞的方法，包括培养外周血细胞得到细胞悬液的步骤，夕卜 周血细胞中含有循环肿瘤细胞，其特征在于采用权利要求4所述的三维硅纳米芯片捕获所 述的循环肿瘤细胞。
8. 如权利要求7所述的分离检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于所述的捕获为：在 装有所述的三维硅纳米芯片的玻片中，均匀加入lml所述的细胞悬液；将玻片置入37°C、 5% C02的培养箱中孵育45min，然后再轻轻的用PBS冲洗5遍；将三维硅纳米芯片置入4% 多聚甲醛中反应20min，再用0. 9ml的0. 2% Triton X-100溶解lOmin增加细胞膜的通透 性，促进细胞内的着色；再将三维硅纳米芯片用DAPI液反应5min，随后用PBS清洗3遍；在 荧光显微镜下观察；将三维硅纳米芯片上的细胞冲洗三遍，用细胞计数仪计数。
9. 如权利要求7所述的分离检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于所述的细胞悬液浓 度为 105cells/ml。
10. -种权利要求4所述三维硅纳米芯片在循环肿瘤细胞检测设备中的应用。
【文档编号】B82Y5/00GK104062162SQ201410326400
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】李阿建, 张亚杰, 林谋斌, 尹路 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院