专利名称：Tob基因在哺乳动物中枢神经系统的功能及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及哺乳动物的Tob基因及其编码产物，及其在诊断和治疗记忆力下降、健忘症等方面用途。此外，本发明还涉及含Tob蛋白的药物组合物和保健品，以及Tob作为筛选提高记忆力、治疗健忘症或提高运动协调能力的相关药物方面的用途。
已知ErbB-2基因编码了一个受体型酪氨酸蛋白激酶(receptor-type proteintyrosine kinase，RPTK)，在细胞生长分化方面发挥重要的作用。它的过量表达能导致肿瘤发生，但其中的机制还有待阐明。
1996年，日本的研究人员发现了一个新的与ErbB-2基因产物p185erbB2相互作用的蛋白分子-Tob(Transducer of ErbB-2)，并克隆了人Tob基因的cDNA序列。Tob与已知的抗增殖因子BTG-1具有一定的同源性。研究显示，与BTG-1相似，Tob也表现出抑制细胞生长的作用，但其作用为p185erbB2所拮抗。随后在人和小鼠，Tob/BTG-1家族的其它成员相继被发现，不过其功能研究仅限于抑制细胞增殖方面。
学习和记忆是脑的基本功能。在高等动物，海马是内侧颞叶的一个脑结构，将之损毁后，新的记忆无法形成。海马的突触具有很强的可塑性。海马突触可被诱导产生及维持长时程增强(long-term potentiation，LTP)，与LTP诱导或维持环节相关的任意一种蛋白质的编码基因被剔除(knockout)后，海马就不再有LTP现象，并且动物也就不能形成记忆。因此，海马作为学习和记忆的重要结构，LTP作为学习记忆的突触机制，已被广大神经科学家所接受。
然而，迄今为止对于参与或影响记忆的各种蛋白质还知之甚少。因此，本领域迫切需要发现新的与记忆有关的蛋白质，以及开发改善记忆或治疗健忘症的药物。
因此，本发明的目的就是提供一种与记忆有关的蛋白-Tob蛋白，及其在诊断、改善、或治疗记忆力下降和健忘症方面的用途。
本发明的另一目的是提供含有Tob蛋白的药物组合物、保健品。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的健忘症易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的Tob基因、转录本和/或蛋白，并与正常的Tob基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患健忘症的可能性高于正常人群。
较佳地，被检测的是人Tob的基因或转录本，并与正常人Tob核苷酸序列比较差异。
在本发明的第二方面，提供了一种治疗健忘症的方法，包括步骤给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常Tob蛋白。
在本发明的第三方面，提供了一种提高哺乳动物记忆力或运动协调能力的方法，包括步骤给需要的对象施用安全有效量的Tob蛋白。
在本发明第四方面，提供了一种保健品，它含有哺乳动物的Tob蛋白或其活性片段。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的哺乳动物的Tob蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的Tob蛋白选自下组动物的Tob蛋白人、大鼠和小鼠。
在本发明的第六方面，提供了一种检测健忘症易感性的试剂盒，它包括特异性扩增Tob基因或转录本的引物，或者与Tob蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第七方面，提供了一种筛选治疗健忘症或提高运动协调能力的药物的方法，它包括步骤(1)将Tob基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Tob蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达Tob蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Tob蛋白表达量的变化；促进Tob蛋白表达量增加的化合物就是治疗健忘症或提高运动协调能力的候选药物。
在本发明的第八方面，提供了一种分离的Tob蛋白，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在附图中，
图1是人、小鼠和大鼠Tob蛋白的保守区域的比较。图中，humantob为人Tob；mousetob为小鼠Tob；rattob为大鼠Tob。
图2是大鼠Tob mRNA的表达谱。其中1-9各泳道分别是脑、海马、心脏、肠、肾、肝、肺、肌肉和脾脏。
图3是大鼠Tob mRNA在海马中的分布图。Tob mRNA主要在海马DG、CA1和CA3区被检出。
图4是小鼠Tob mRNA在脑内的分布图。Tob mRNA主要在海马及小脑皮层被检出。
图5是水迷宫示意图，图中的“○”表示隐藏平台的所在位置。
图6显示了Tob基因的反义序列核酸对大鼠Morris水迷宫学习和记忆保持的影响。
图7显示了在对照组和反义核酸组大鼠海马CA1区记录到的LTP。
图8显示了在九种不同品系小鼠中，Tob反义核酸序列均对记忆能力有负面影响。第1组为BALB/c小鼠+盐水；第2组为BALB/c小鼠+Tob随机序列；第3-9组为不同品系小鼠+Tob反义序列。
如本文所用，术语“Tob蛋白”和“Tob多肽”可互换使用，指在哺乳动物的海马中特异性表达的、氨基酸序列与人、大鼠或小鼠的Tob氨基酸序列有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上同源性的多肽。此外，Tob的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用于本发明。
本发明人经过广泛而深入的研究，不仅克隆了大鼠的Tob cDNA序列，而且还利用不同的动物行为学模型，对Tob基因在学习和记忆过程中的功能进行了研究。意外地发现，Tob与记忆以及运动协调能力有关。
以人和小鼠Tob1基因的cDNA保守区域为参照设计了一对引物，通过PCR，在8周大鼠脑cDNA文库中克隆了一段DNA序列。测序结果表明，该序列长度为604bp，与人和小鼠Tob1的cDNA相应区域分别具有91％和90％的同源性(图1)。以该段序列为探针，通过筛选成年大鼠脑cDNA文库，已克隆到大鼠Tob基因全长cDNA。Northern印迹杂交结果显示，大鼠Tob基因的表达模式与人和小鼠的比较相似(图2)。原位杂交结果表明，Tob基因在大鼠海马的神经元中有特异性表达(图3)。
以大鼠为实验动物，通过水迷宫(Water Maze)和环境恐惧(Fear-conditioningto Context)等行为学实验模型对Tob基因进行了功能检测。向海马CA1区域定位注射Tob基因反义核酸，结果发现大鼠Tob基因的反义核酸可显著抑制大鼠的学习和记忆能力(图6)；抑制CA1区突触的长时程增强(LTP；图7)。
以小鼠为实验动物，用Hamilton微量注射器定时定量将小鼠Tob基因的反义核酸注射到小鼠的侧脑室，并以注射生理盐水和随机序列核酸(Scramble)为对照组，而后考察实验组与对照组在步下法试验(Step-down Test)中的表现，并对所得数据进行统计分析。结果表明，实验组(注射Tob反义核酸组)的记忆能力与对照组相比有显著性减弱。为了进一步证实Tob基因与学习记忆的相关性，选用了9个不同品系的实验小鼠对之进行功能复筛。结果表明，Tob基因反义核酸在各品系中均能显著地抑制小鼠的学习记忆能力(图8)。
此外，鉴于Tob mRNA在小脑皮层中的特异性表达，提示Tob蛋白与运动协调能力有关(图4)。
根据蛋白质同源性比较，人类的Tob蛋白与小鼠和大鼠Tob蛋白高度同源(相同性在90％以上)。哺乳动物Tob蛋白的结构以及组织分布的特异性均提示，Tob蛋白在不同的哺乳动物中具有相同的功能，即可改善记忆力并且提高运动协调能力。因此人类的Tob蛋白同样与人的记忆力和运动协调能力有关，根据人Tob基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类的健忘症，并可改善记忆和提高运动协调能力。
Tob核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已知的人Tob、小鼠Tob或本发明所公开大鼠Tob的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
可用于本发明的Tob蛋白可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含Tob编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达Tob蛋白，然后分离和纯化出Tob蛋白。
具体而言，本发明的Tob蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗Tob蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如记忆力下降)，和用于筛选促进Tob蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组Tob蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人Tob蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对Tob DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Tob基因产物或片段。较佳地，指那些能与Tob基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Tob蛋白的分子，也包括那些并不影响Tob蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Tob基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Tob蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用例如人、大鼠或小鼠Tob基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与Tob基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗Tob蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Tob蛋白。
多克隆抗体的生产可用Tob蛋白或多肽免疫动物，如家兔，羊等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Tob蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。在筛选时，可以将Tob蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响Tob蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。此外，还可将测试化合物与Tob蛋白一起施用于实验动物，与对照相比存在动物记忆力的变化就表明，该化合物是Tob蛋白的激动剂或拮抗剂。
此外，还可将Tob基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备高表达Tob蛋白的细胞株并以此细胞株中的Tob蛋白为靶位点，筛选对Tob蛋白有激活或抑制作用的药物。并向所述的表达Tob蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Tob蛋白表达量的变化。促进Tob蛋白表达的化合物就是治疗健忘症的候选药物，而抑制促进Tob蛋白表达的化合物可用作使人们忘记不希望要的回忆的药物。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、皮下、口服、或局部给药。
正常的Tob多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于健忘症方面的治疗。在使用本发明Tob蛋白时，还可同时使用其他治疗健忘症的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Tob蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的Tob蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
Tob蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于Tob蛋白的无表达或异常/无活性的Tob蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带Tob基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人Tob基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测Tob蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的Tob蛋白水平，可以用作解释Tob蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断Tob蛋白起作用的疾病。
一种检测样品中是否存在Tob蛋白的方法是利用Tob蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与Tob蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Tob蛋白。
Tob蛋白的多聚核苷酸可用于Tob蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，Tob蛋白的多聚核苷酸可用于检测Tob蛋白的表达与否或在疾病状态下Tob蛋白的异常表达。如Tob DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断Tob蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用Tob蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测Tob基因的转录产物。
检测Tob基因的突变也可用于诊断Tob蛋白相关的疾病。Tob蛋白突变的形式包括与正常野生型Tob DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的Tob蛋白不仅可用于治疗记忆力下降或有缺陷的对象，也可用于提高正常个体的记忆力。因此，本发明还提供了一种保健品，它含有哺乳动物的Tob蛋白或其活性片段。本发明保健品，可通过保健品领域常规的方法，通过将哺乳动物的Tob蛋白或其活性片段与合适的稀释剂、食品等混合在一起而制备。优选的保健品是片剂、颗粒剂、口服剂形式。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例实施例1大鼠Tob cDNA序列的获得以人和小鼠Tob1基因的cDNA保守区域为参照设计了引物，通过PCR，在8周大鼠脑cDNA文库(用常规方法构建)中克隆了一段DNA序列。以该段序列为探针，通过筛选8周大鼠脑cDNA文库，得到了大鼠Tob1基因全长cDNA。测序结果表明，该cDNA长度为2024bp，具体序列如SEQ ID NO1所示。其中，开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)为146～1243bp，编码的大鼠Tob1蛋白含有365aa，序列如下MQLEIQVALN FIISYLYNKL PRRRVNIFGE ELERLLKQKY EGHWYPEKPY KGSGFRCIHV 60GEKVDPVIEQ ASKESGLDID DVRGNLPQDL SVWIDPFEVS YQIGEKGPVK VLYVDDSNEN 120GCELDKEIKN SFNPEAQVFM PISDPASSVS SSPSPPFGHS AAVSPTFMPR STQPLTFTTA 180TFAATKFGST KMKNSGRSSK VARTSPISLG LNVNVNDLLK QKAISSSMHS LYGLGLGSQQ 240QPQPQPQQPP SQPPPPPPPP QQQQQHQQQQ QQQQQQQQQP QQQTSALSPN AKEFIFPNMQ 300GQGSSTNGMF PGDSPLNLSP LQYSNAFNVF AAYGGLNEKS FVDGLNFSLN NIQYSNQQFQ 360PVMAN 365(SEQ ID NO2)同源比较表明，人、小鼠、大鼠Tob有很高的同源性。
1.cDNA的同源性大鼠Tob1基因cDNA与人和小鼠Tob1的cDNA在DNA水平上分别具有90％和93％的同源性。
2.蛋白质的同源性大鼠Tob1蛋白与人和小鼠Tob1蛋白在氨基酸水平上分别具有97％和95％的同源性。
实施例2Tob的组织分布Northern印迹法提取大鼠各种组织的总RNA，变性胶电泳后将RNA转印到尼龙膜上，该膜与α-32P-dATP标记的探针进行杂交，最后通过放射自显影显示杂交结果，得知目的基因在不同组织中的表达分布情况。
Northern印迹杂交结果显示，大鼠Tob1基因的表达模式与人和小鼠的比较相似(图2)。
实施例3Tob在脑中的分布原位杂交按常规方法，对动物脑组织样品用多聚甲醛固定后制作石蜡包埋切片，组织切片经过脱蜡、复水、固定、消化、后固定、预杂交等过程，与地高辛(Digoxin)标记的探针进行杂交，之后通过碱性磷酸酶连接的抗地高辛抗体检测目的基因在脑中的分布。
原位杂交结果表明，Tob1基因在大鼠海马的神经元中有特异性表达(图3)。这与小鼠中Tob基因的分布情况相同(图4)。
实施例4Morris水迷宫实验一、实验设备及环境迷宫直径＝150cm，高＝45cm；平台直径＝10cm，浸入水面约2cm；摄像机、采样设备和软件；水温24-27℃，加入对大鼠无害的染料；使大鼠看不到隐藏在水面下的平台。
二、实验动物和核酸序列雄性SD大鼠，体重为180g-210g。分为三组，Tob-反义核酸序列组8只；随机核酸序列组8只；空白对照组(10只)。
Tob反义核酸序列(1)5’-act tgg att tca agc tgc at-3’(2)5’-act tct cgt tga ggc ctc cg-3’随机核酸序列5’-gac tga cat gcg att gag ct-3’
三、手术在大鼠双侧海马CA1区埋植引导管，用于行为实验给药，大鼠手术后7-12天，进Morris水迷宫训练。
四、给药在行为训练前6小时在CA1区给药。Tob-反义序列和随机序列的浓度均为1nmol/ul，剂量为每侧CA1区1.5μl。
五、训练方法每次训练将大鼠分别从水迷宫的四个位置(如图5所示)，面向缸壁，随机放入(但确保大鼠从每个位置出发的机会是均等的)。让它在水中搜索60s，如果找到平台，就让它在平台上停留30s，然后放回笼子休息30s后，进行下一次训练；如果没有找到平台，就人为地将它引导到平台上，停留60s后，开始下一次训练。训练分两步进行，每只大鼠连续训练6次后，休息1小时，再进行下一步的训练，一共训练12次。记录大鼠找到平台所需要的时间。
六、测试方法1.隐藏平台的测试方法训练后48小时进行测试，目的是为了检测大鼠的记忆保持能力。测试一共进行3次，每次大鼠从一个固定的位置出发，同样是在水中搜寻60s。如果在60s内找到平台；就将它立即放回笼子，休息60s后，开始下一次测试；如果在规定60秒时间内没有找到平台，就将它引导到平台上停留30s后，放回笼子休息30s，然后开始下一次测试，同样记录大鼠找到平台所需要的时间。
2.露出平台的测试方法本测试是在所有测试结束后；将平台露出水面进行的。目的是为了观察大鼠是否有视觉认知方面的障碍，从而影响它寻找平台的能力。测试一共进行3次，每次大鼠都从一个固定的位置出发，但是露出平台的位置却是随机变动的。每次测试先将大鼠放在平台上适应30s，然后从固定的位置放入水中，搜寻60s。如果在60s内找到平台，就立即放回笼子休息60s后，开始下一次测试，如果没有找到平台，就将它从水中取出，放回笼子休息60s后开始下一次测试，实验结果表明，三组大鼠在平台上适应30s后，都可以迅速找到平台，组间无显著性差异。
七、实验结果如图6所示。横坐标是训练次数及48小时记忆检测，纵坐标是大鼠找到平台所需要的时间(为3次训练或检测的平均值)。双侧海马CA1区注射Tob基因的反义核酸序列后，大鼠Morris水迷宫学习速度显著减慢，48小时记忆保持能力也相应降低。
实施例5海马CA1区长时程增强(LTP)电生理记录在该实施例中，将Tob基因的反义序列、随机序列核酸或生理盐水局部注射到大鼠海马的CA1区，观察其对CA1区突触传递长时程增强(Long-termpotentiation，LTP)的影响，从海马突触可塑性的角度研究Tob基因在学习和记忆中的作用。
一、实验动物和核酸序列雄性SD大鼠，体重为200-250g。分为三组，Tob-反义核酸序列组8只；随机核酸序列组8只；生理盐水对照组6只。
Tob反义核酸序列(1)5’-act tgg att tca agc tgc at-3’(2)5’-act tct cgt tga ggc ctc cg-3’随机核酸序列5’-gac tga cat gcg att gag ct-3’二、手术用乌拉坦(1250mg/kg体重，腹腔注射)麻醉大鼠。然后把大鼠固定在立体定位仪上。切开头皮。清洁颅骨表面。分别在P4.9L3.8和P3.4L2.8两个位点钻直径1.5mm的孔，P4.9L3.8处的孔用于插刺激电极，P3.4L2.8处的孔用于插记录电极。室内温度保持在25度，动物体温保持在37度。
三、刺激和记录电极刺激电极为同心圆电极，即在不锈钢针管内套1根漆包线，针管内径与漆包线直径为0.2mm。记录电极为单极电极，用1根直径为0.2mm的漆包线制成。记录电极和1根不锈钢管(外径0.7mm，内径为0.4mm)粘在一起。注射药物的针头通过此不锈钢管到达记录部位。
四、电位记录1、电极的定位将刺激电极定位在海马的Shaffer通路，把记录电极定位在CA1区。以单脉冲方波(波宽50us)刺激Shaffer通路，在CA1记录最佳兴奋性突触后电位(EPSP)。
2、给药方法通过记录电极旁的不锈钢管把药物注射针头插到记录部位，以0.2ul/min的速度将浓度为1.0nmol的反义序列核酸1.0ul或浓度为1.0nmol的随机序列核酸1.0ul或生理盐水1.0ul注射到记录部位，9个小时后再注射1.0ul。
3、最佳刺激强度选择单脉冲方波(波宽50us)刺激Shaffer通路，并从小到大调整刺激强度(100-800uA)，记录不同刺激强度下的EPSP，并作刺激反应强度曲线。以引起最大EPSP反应的刺激强度的2/3，为最佳刺激强度。
4、电位的记录第2次注射的2.5小时后，以最佳强度的单个电脉冲(50us)刺激Shaffer通路，记录CA1区的EPSP反应，每1分钟刺激和记录1次，连续30min。然后对Shaffer通路进行强直刺激(20个电脉冲串，脉冲间隔5us，共3串刺激，每串间隔30s)。强直刺激后，同样以最佳强度的单个电脉冲(50us)刺激Shaffer通路，记录CA1区的EPSP反应，每1分钟刺激和记录1次，连续6小时。强直刺激时的时间正好是第1次给药后的12小时，第2次给药后的3小时。6小时记录结束后，以同样的参数再次对Shaffer通路进行强直刺激，然后，同样以最佳强度的单个电脉冲(50us)刺激Shaffer通路，记录CA1区的EPSP反应，每1分钟刺激和记录1次，连续1小时。
五、数据处理与分析把连续5次或10次记录到EPSP波形进行平均叠加，计算平均叠加后的EPSP电位的上升相的斜率。以强直刺激前的EPSP斜率的平均值为100％，计算强直刺激前、后每个时间点上的EPSP斜率。用EPSP斜率对时间作图。
六、实验结果实验结果如图7所示。注射Tob基因的反义核酸后，CA1区突触电位的长时程增强(LTP)显著地小于随机序列对照组或生理盐水对照组的LTP，提示CA1的Tob基因参与长时程增强的诱导和维持。
实施例6步下法试验测定Tob基因对小鼠记忆能力的影响步下行为可用步下法(Step Down Test)[陈双双，管林初，鲍世民，金玫蕾，四种不同品系小鼠旷场行为和记忆的比较研究，心理科学1994年第17卷第1期，39-41页]进行测试实验装置为20×20×30cm的透明塑料箱，箱底为金属电路板，左角放置一个8×8×1.5cm的平台为安全区。实验开始前先进行训练将小鼠放入实验箱内自由活动1分钟，然后将小鼠轻轻赶上小平台(一般情况下小鼠很快会从平台上下来)，记录小鼠从完全登上小平台到下来时的间隔秒数(潜伏期)。连续重复3次后，再将小鼠赶上小平台，并将箱底的电路板立即通电(50V，0.5mA)。当小鼠再次跳下小平台受到电击后，即跳回平台以逃避电击，此时则视为训练完毕，将小鼠取出放回饲养笼。训练后24小时再将小鼠放入实验箱内的小平台上，箱底的电路板不通电，记录小鼠从放上小平台到下来的间隔期秒数。训练后48小时再同样记录一次间隔期时间。为了更好地观察和评价动物的记忆行为，参照有关文献增加了训练次数和48小时后的观察。
在本实施例中，所用的第1组为BALB/c小鼠+盐水；第2组为BALB/c小鼠+随机序列核酸；第3-9组为不同品系小鼠+Tob反义序列核酸。Tob反义核酸序列和随机核酸序列与实施例4相同。
结果如图8A(24小时)和8B所示(48小时)，反义核酸实验组的记忆能力与对照组相比有显著性减弱，且在各品系小鼠中均能显著地抑制小鼠的学习记忆能力。
序列表<110>中国科学院上海生物化学研究所中国科学院上海生理研究所中国科学院上海生物工程研究中心<120>Tob基因在哺乳动物中枢神经系统的功能及其应用<130>005781<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2024<212>DNA<213>大鼠<220><221>CDS<222>(146)..(1243)<400>1gaccacggaa ggttgaagga taatcttcta gtaccagcac tttgaatgag aatttgtttc 60tctgccacaa actgattttt ttttttaaat tttatttttc tggtggagga gttgaaacaa 120acctaccttt tgtggcatcg cagct atg cag ctt gaa att caa gta gca cta172Met Gln Leu Glu Ile Gln Val Ala Leu1 5aat ttt att att tcc tat ttg tac aat aag ctt ccc agg aga cgt gtc220Asn Phe Ile Ile Ser Tyr Leu Tyr Asn Lys Leu Pro Arg Arg Arg Val10 15 20 25aac att ttt ggt gaa gaa ctt gaa aga ctt ctt aaa cag aaa tat gaa268Asn Ile Phe Gly Glu Glu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Gln Lys Tyr Glu30 35 40ggg cat tgg tat cct gag aag cca tac aaa ggc tca ggg ttt aga tgc316Gly His Trp Tyr Pro Glu Lys Pro Tyr Lys Gly Ser Gly Phe Arg Cys45 50 55ata cac gta ggg gag aag gtg gac ccg gtg atc gag caa gcg tcc aaa 364Ile His Val Gly Glu Lys Val Asp Pro Val Ile Glu Gln Ala Ser Lys60 65 70gag agt ggt ctg gac 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1.一种对个体的健忘症易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤检测该个体的Tob基因、转录本和/或蛋白，并与正常的Tob基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患健忘症的可能性高于正常人群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的是人Tob基因或转录本，并与正常人Tob核苷酸序列比较差异。
3.一种治疗健忘症的方法，其特征在于，包括步骤给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常Tob蛋白。
4.一种提高哺乳动物记忆力或运动协调能力的方法，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用安全有效量的Tob蛋白。
5.一种保健品，其特征在于，它含有哺乳动物的Tob蛋白或其活性片段。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的哺乳动物Tob蛋白以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的Tob蛋白选自下组动物的Tob蛋白人、大鼠和小鼠。
8.一种检测健忘症易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增Tob基因或转录本的引物，或者与Tob蛋白特异性结合的抗体。
9.一种筛选治疗健忘症的药物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)将Tob基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达Tob蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达Tob蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测Tob蛋白表达量的变化；促进Tob蛋白表达量增加的化合物就是治疗健忘症的候选药物。
10.一种分离的Tob蛋白，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及哺乳动物的Tob基因及其编码产物,及其在诊断和治疗记忆力下降、健忘症等方面用途。此外,本发明还涉及含Tob蛋白的药物组合物和保健品,以及Tob作为筛选提高记忆力、治疗健忘症或提高运动协调能力的相关药物方面的用途。
文档编号G01N33/566GK1370843SQ01105448
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月27日 优先权日2001年2月27日
发明者景乃禾, 李葆明, 金玫蕾, 高翔, 王新明, 郭宁, 涂艳阳, 张雪寒 申请人:中国科学院上海生物化学研究所, 中国科学院上海生理研究所, 中国科学院上海生物工程研究中心