专利名称：活性氧物质用电极以及采用该电极的传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及活体内活性氧物质用电极以及采用该电极测定活性氧物质的浓度用的传感器，所述活性氧物质是例如过氧化物阴离子自由基(O2-·)。更具体地说，本发明涉及适用于体内测定而无需采用大量的酶且不会引起酶失活问题的测定活性氧物质用的电极以及测定活性氧物质的浓度用的传感器。
背景技术：
作为活性氧物质的过氧化物阴离子自由基(O2-·)是通过由黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(XOD)将黄嘌呤或次黄嘌呤等氧化成尿酸和由血红蛋白还原氧等方式在体内产生的。过氧化物阴离子自由基在合成生理活性物质、杀菌作用和衰老等过程中起重要作用。据报道，衍生自过氧化物阴离子自由基的多种活性氧物质会引起如癌症等各种疾病。因而，据信测定活体内包括过氧化物阴离子自由基在内的活性氧物质的浓度对于精确确定这些不同疾病是非常重要的。
当没有底物存在时，这些过氧化物阴离子自由基通过如以下式(1)所示的歧化反应生成过氧化氢(H2O2)和氧分子(O2)。这种歧化反应包括通过给过氧化物阴离子自由基加一个质子形成HO2·，通过HO2·与氧分子反应形成过氧化氢和氧分子，以及通过HO2·自由基的碰撞形成过氧化氢和氧分子(反应式(1)-(4))。
(1)(2)(3)(4)
在该反应系统中，过氧化物阴离子自由基具有电子受体(氧化剂)、电子给体(还原剂)以及氢离子受体(碱)的功能。前两个功能已被用于测定过氧化物阴离子自由基的浓度。例如，可采用将高铁细胞色素C(三价)转化为亚铁细胞色素C(二价)的反应、通过氮蓝四唑(NBT)生产蓝色甲的反应以及还原四硝基甲烷(TNM)的反应来测定过氧化物阴离子自由基浓度。所有这些反应均在体外条件下进行。
另一方面，对体内定量测定过氧化物阴离子自由基浓度的方法进行了研究。例如，McNeil等、Tariov等以及Cooper等均报道了可通过电化学方法来测定过氧化物阴离子自由基的浓度，其方法是用作为酶的N-乙酰半胱氨酸来修饰金或铂电极表面，并使蛋白质例如细胞色素C经S-Au键固定化来制备酶电极(细胞色素C固定化电极)，所述的细胞色素C是具有被称作血细胞(hem)的铁络合物作为氧化还原中心的金属蛋白质(C.J.McNeil等，Free Radical Res.Commun.，7，89(1989)；M.J.Tariov等，J.Am.Chem.Soc.113，1847(1991)；以及J.M.Cooper，K.R.Greenough和C.J.McNeil，J.Electroanal.Chem.，347，267(1993))。
该方法基于下述测定原理。即，按照反应式(5)，细胞色素C(三价)(cyt.C(Fe3+))与过氧化物阴离子自由基反应，并被还原为细胞色素C(二价)(cyt.C(Fe2+))。接着，按照反应式(6)，被O2-还原的细胞色素C(二价)再被电化学氧化。测定该反应生成的氧化电流，从而以间接的方式定量测定过氧化物阴离子自由基的浓度。
(5)(6)然而，由于细胞色素C是一种存在于体内细胞内的线粒体膜上的电子传递蛋白，制备该电极需要大量的细胞(如105-106个细胞)，以使其上固定的细胞色素C的量足以满足测定的需要。另外，使用的酶在数天内就会失活。因而，需要发展无需大量的酶也不会引起酶失活问题、能够检测活性氧物质如过氧化物阴离子自由基的电极。
发明内容
考虑到这些情况，本发明的发明人进行了广泛的研究，以获得一种能够通过氧化还原反应来测定活性氧物质如过氧化物阴离子自由基的电极。结果，发明人发现，通过在导电元件的表面形成金属卟啉络合物的聚合膜而制得的电极，不需要大量的酶，可避免失活问题，并可适用于检测活性氧物质并测定它们的浓度，所述的金属卟啉络合物是通过将金属离子引入卟啉化合物的中心形成的。
具体地说，本发明提供了一种活性氧物质用电极，该电极包含表面具有金属卟啉络合物聚合膜的导电元件。
本发明还提供了一种测定活性氧物质的浓度用的传感器，该传感器具有活性氧物质用电极、对电极和参比电极，所述活性氧物质用电极具有表面形成了金属卟啉络合物聚合膜的导电元件。
此外，本发明还提供了一种测定样品中活性氧物质的方法，所述方法包括采用上述传感器来测定金属卟啉聚合膜中的金属与所述活性氧物质之间生成的电流的步骤。
图1是用于制备本发明的电极的三电极电池的例子的图示。
图2是用于制备本发明的电极的两室三电极电池的例子的图示。
图3是用于制备本发明的电极的针型电极和两室三电极电池的例子的图示；其中(A)为两室三电极电池，(B)是完整的针型电极，以及(C)是针型电极的端部。
图4是一种用于制备本发明的电极的经改进的针型电极的图示。这种电极是图3的针型电极的改进，其中(A)显示的是完整的经改进的针型电极，以及(B)为经改进的针型电极的端部。
图5是一个用于测定活性氧物质的测定装置的例子的图示。
图6是一个用于测定活性氧物质的测定装置的例子的图示。
图7是H2T3ThP的紫外可见光谱图(7(a))和FeT3ThP的紫外可见光谱图(7(b))。
图8是H2T2AmP的紫外可见光谱图(8(a))和FeT2AmP的紫外可见光谱图(8(b))。
图9是表示电解聚合FeT3ThP过程中CV曲线的图表。
图10是表示在制备FeT2AmP电极时电解聚合过程中CV曲线的图表。
图11是表示在将XOD添加于对比产品1过程中氧化电流随时间变化的图表。
图12是表示在将XOD添加到本发明产品1过程中氧化电流随时间变化的图表。
图13是(XOD活度)1/2与本发明产品1以及对比产品1中电流的增加量的关系图。
图14是表示当本发明产品4的XOD浓度增加到100mU/ml(毫单位/毫升)时，电流随时间变化的图表。
图15是过氧化物阴离子自由基的量与电流变化量的关系图。
具体实施例方式
本发明的活性氧物质用电极(在下文中简称“电极”)包括表面上具有金属卟啉络合物聚合膜的导电元件。
通常任何常用于电极的元件均可不受限制地用作本发明的电极的导电元件。其例子包括碳，如玻璃化炭黑(GC)、石墨、热解石墨(PG)、高取向热解石墨(HOPG)以及活性炭等；贵金属，如铂、金和银等；以及In2O3/SnO2(ITO)等。在这些物质中，考虑到经济效益、加工性能、轻便等特征，特别优选玻璃化炭黑。所述导电元件的形状没有特别的限制，只要其形状适合用作电极即可。可采用各种形状，如圆筒状、四棱柱状、针状以及纤维状。例如，在测定体内活性氧物质的浓度时优选类似于针状的电极。
金属卟啉络合物聚合膜形成于本发明的导电元件的表面。作为用于制造所述聚合膜的金属卟啉络合物的例子，可给出下列式(I)或式(II)化合物
其中，M是选自由铁、锰、钴、铬和铱组成的组中的一种金属，四个R中至少一个为选自由下列基团组成的组中的基团硫代呋喃基、吡咯基、呋喃基、巯基苯基、氨基苯基和羟基苯基，其他R代表这些基团中的任一基团、烷基、芳基或者氢。
其中，M及R与上述限定的相同，两个L中至少一个是含氮的轴向配体，例如咪唑及其衍生物、吡啶及其衍生物、苯胺及其衍生物、组氨酸及其衍生物以及三甲胺及其衍生物；含硫的轴向配体，例如苯硫酚及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物以及甲硫氨酸及其衍生物；或者含氧的轴向配体，例如苯甲酸及其衍生物、乙酸及其衍生物、苯酚及其衍生物、脂肪醇及其衍生物以及水；另一个L是这些轴向配体中的任一配体或者不带配体的基团。
上述式(I)或式(II)所表示的金属卟啉络合物是金属原子与卟啉化合物配位的络合化合物。这种卟啉化合物是一种由四个吡咯环形成的环状化合物，其中四个次甲基共同结合于α位且四个氮原子的位置是面对面朝向中心。络合化合物(金属卟啉络合物)可通过在所述中心插入金属原子形成。为制备这种化合物，可采用传统的制造金属络合物的方法，例如通过金属化作用将金属原子引入卟啉中心的方法。在本发明中，各种金属如铁、锰、钴、铬和铱均可用作被引入卟啉化合物中心的金属。
可根据需要测定的活性氧物质的类型来选择合适的金属原子。例如，测定过氧化物阴离子自由基时优选使用铁、锰和钴等金属原子；测定分子氧时优选使用铁、钴、铬和铱等金属原子；测定过氧化氢时优选使用铁和锰等金属原子；测定·OH、NO、ONOO-时优选使用铁和锰等金属原子。
本发明采用的卟啉络合物优选在按照IUPAC命名原则编号的5、10、15和20位置中，至少一个位置被硫代呋喃基、吡咯基、呋喃基、巯基苯基、氨苯基或羟苯基等基团取代，其余位置由这些基团中的任一基团、烷基、芳基或者氢取代。下列的络合物可作为具体例子5，10，15，20-四(2-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-羟基苯基)卟啉、[5，10，15-三(2-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、[5，10，15-三(3-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、 卟啉、[5，10-二(3-硫代呋喃基)-15，20-双苯基]卟啉、[5，15-二(2-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5，15-二(3-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5-单(2-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉以及[5-单(3-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉。
在式(II)化合物的L所表示的配体中，作为所述咪唑衍生物的例子，可以是甲基咪唑、乙基咪唑、丙基咪唑、二甲基咪唑和苯并咪唑；作为所述吡啶衍生物的例子，可以是甲基吡啶、吡啶基乙酸甲酯、烟碱、哒嗪、嘧啶、吡嗪以及三嗪；作为所述苯胺衍生物的例子，可以是氨基苯酚和苯二胺；作为所述组氨酸衍生物的例子，可以是组氨酸甲酯、组胺以及马尿酰基-组氨酰基-亮氨酸；作为所述三甲胺衍生物的例子，可以是三乙胺和三丙胺；作为所述苯硫酚衍生物的例子，可以是甲苯硫酚、巯基苯酚、巯基苯甲酸、氨基苯硫酚、二巯基苯以及甲苯二硫酚；作为所述半胱氨酸衍生物的例子，可以是半胱氨酸甲酯和半胱氨酸乙酯；作为所述甲硫氨酸衍生物的例子，可以是甲硫氨酸甲酯和甲硫氨酸乙酯；作为所述苯甲酸衍生物的例子，可以是水杨酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸以及对苯二甲酸；作为所述乙酸衍生物的例子，可以是三氟乙酸、巯基乙酸、丙酸和丁酸；作为所述苯酚衍生物的例子，可以是甲酚和二羟基苯；作为所述脂肪醇衍生物的例子，可以是乙醇和丙醇。
本发明中可采用例如电解聚合法、溶液聚合法以及多相聚合法等各种聚合方法在所述导电元件的表面形成金属卟啉络合物聚合膜。在这些方法中，优选电解聚合法。具体地说，金属卟啉络合物聚合膜可通过聚合反应形成于所述导电元件的表面。所述的聚合反应可通过下述方法进行采用双电极(工作电极和对电极)电解或三电极(工作电极、对电极和参比电极)电解，采用合适的溶于有机溶剂的支持电解质，采用导电元件作为工作电极，以不溶解的电极如贵金属电极(例如Pt电极)、钛电极、碳电极或者不锈钢电极作为对电极，以饱和甘汞电极(SCE)或银-氯化银电极等电极作为参比电极，其中，所述的三电极电解包括三电极恒电位电解、三电极恒电流电解、三电极可逆电位扫描电解以及三电极脉冲电解，所述的支持电解质有例如高氯酸四丁铵(TBAPBu4NClO4)、高氯酸四丙铵(TPAPPr4NClO4)或高氯酸四乙铵(TEAPEt4NClO4)，所述的有机溶剂有例如二氯甲烷、氯仿或者四氯化碳。
优选通过采用例如图1所示的三电极电池的可逆电位扫描电解法等方法来进行电解聚合。在图1中，1表示电池容器；2为导电元件；3为对电极；4为参比电极；5为金属卟啉络合物溶液；6为恒电位仪；以及7为X-Y记录仪。
当采用高浓度金属卟啉络合物溶液时，可采用如图2所示的两室三电极电池。在图2中，编号1-7表示与图1中的1-7相同的元件，8表示电解液，9为样品瓶。
考虑到体内测定、复合测定以及临床诊断和治疗等，为了制得活性氧物质用简化电极(针型电极)，可采用如图3(A)和3(B)所示的针型电极10和三电极电池。在图3中，1表示电池容器；4为参比电极；5为金属卟啉络合物溶液；6为恒电位仪；7为X-Y记录仪；8为电解液；9为样品瓶；10为针型电极；11为对电极；12为导电元件的端部(金属卟啉聚合膜区域)，13为电绝缘材料；以及14为对电极导线。
如图3(C)中所示，这种电极采用了对电极11，该对电极11是通过用导电元件填充由电绝缘材料制成的细管13，再以用作所述对电极的金属覆盖该细管而制得的。通过将金属卟啉聚合膜覆盖于所述导电元件的端部12的表面，可将该电极用作针型电极。
所述金属卟啉络合物聚合膜的厚度可根据电极类型、金属卟啉络合物以及待测的活性氧类型适当地确定。考虑到电极活性和修饰稳定性等特征，其厚度优选1μm或更少。
基于图3中显示的活性氧物质用简化电极(针型电极)，为了使所制得的活性氧物质用简化电极(经改进的针型电极)具有去除活体内不必要的电流、电流噪声等和提高灵敏性、信/噪比(S/N比率)等目的，举例来说，可采用如图4(A)所示的经改进的针型电极15以及如图3(A)所示的三电极电池。在图4中，11表示对电极；12为导电元件的端部(金属卟啉聚合膜区域)；13为电绝缘材料；14为对电极导线；15为改进的针型电极；16为接地点；17为接地线。
如图4(B)所示，该电极有一个插入电绝缘材料13中的导电元件(两层结构)。电绝缘材料13位于对电极材料11中(三层结构)，对电极材料11封装在电绝缘材料13中(四层结构)，最后，所得的细管的外部用一种材料例如能起到接地点作用的金属进行涂覆(五层结构)。涂覆材料充当了接地点16。在其导电元件的端部12的表面形成一层金属卟啉聚合膜，该电极就可用作测定活性氧物质用的经改进的简化电极(改进/针型电极)。
所述金属卟啉络合物聚合膜的厚度可根据电极类型和金属卟啉络合物以及待测的活性氧的类型适当地确定。考虑到电极活性、修饰稳定性等问题，其厚度优选1μm或更薄。这种改进/针型电极也可用于复合测定等。在这种情况下，可制作具有多达10层或更多层结构的电极。作为接地用材料，可采用贵金属如铂、金、钛、不锈钢和银以及耐腐蚀合金如铁-铬合金或碳等材料。由于该接地点频繁地在体内使用，优选安全性高的材料如贵金属(例如铂、金、银)、钛、不锈钢和碳。
为了使用本发明的电极测定活性氧物质，尤其是为了测定活性氧物质的浓度，优选将该电极与(1)一个对电极与一个参比电极(三电极型)或者(2)一个对电极(两电极型)结合使用。作为这种对电极材料，可采用贵金属如铂、金和银以及耐腐蚀合金如铁-铬合金或碳等。由于所述对电极频繁地在体内使用，优选安全性高的材料如贵金属(例如铂、金、银)、钛、不锈钢和碳。
作为所述参比电极，通常可采用各种参比电极，如银/氯化银电极和汞/氯化汞电极。也可采用固体标准电极。
图5中显示了可用于测定活性氧物质的测定装置的具体例子。在图5中，编号1、3、4、6和7表示与图1中相同的元件，18表示测量电极(工作电极)，19表示微量注射器，20表示待测溶液，21表示磁力搅拌器，22为搅拌子。
图6中显示了可用于测定活性氧物质的测定装置的另一个具体例子。在图6中，数字1、6、7及19-22表示与图4中相同的元件，10表示针型电极。
本发明的活性氧物质用电极不但可用作使用上述装置来测定活性氧物质如过氧化物阴离子自由基的电极，该电极还可通过与(1)一个对电极与一个参比电极(三电极型)或者(2)一个对电极(两电极型)结合使用来作为测定活性氧物质的浓度用的传感器。例如，如果将这种构造的测定活性氧物质浓度的传感器用于包含过氧化物阴离子自由基的体系，形成聚合膜的金属卟啉络合物中的金属将被该过氧化物阴离子自由基还原。例如，如果该金属为铁，Fe3+将被该过氧化物阴离子自由基还原为Fe2+(反应式(7))。
将测定浓度用的电极保持在可氧化Fe2+程度的电位((1)对于三电极型而言)或者电压((2)对于两电极型而言)下，此时如果所述已由过氧化物阴离子自由基还原的Fe2+再被电化学氧化(反应式8)，则这种情况下流过的电流(氧化电流)与过氧化物阴离子自由基的浓度相关。因此，可根据所述氧化电流来定量测定样品中溶解的过氧化物阴离子自由基的浓度。尤其是，可基于与上述反应式(5)与(6)相同的原理来测定过氧化物阴离子自由基的浓度。基于该原理的定量检测也可适用于例如过氧化氢和·OH等活性氧物质以及如NO和ONOO-等其它活性自由基物质。
(7)(8)这里“Por”指的是卟啉。
由于本发明的活性氧物质用电极在其导电元件的表面具有金属卟啉络合物聚合膜，所以，与传统的细胞色素C固定化电极相比，本发明的电极的强度显著提高，并且不存在失活问题。此外，由于所述金属卟啉聚合膜通过电解聚合反应等方法形成，所以，与传统的电极相比，本发明的电极的制备非常容易。本发明的电极可被制成尤其适合于体内应用的形状，例如针样的形状。
在这种情况下，本发明的活性氧物质用电极不仅可以定性地检测如过氧化物阴离子自由基、过氧化氢及·OH等活性氧物质以及其它活性自由基物质(NO、ONOO-等)，还可以通过与对电极和参比电极结合，在包括体内及体外环境的任何环境下，对这些活性氧物质进行定量测定。因而本发明的电极可广泛用于各个领域。
特别地，由于可根据体内的活性氧物质及其它的活性自由基物质来精确确定各种疾病，所以，举例来说，可通过测定血液中的活性氧物质的浓度来检测如癌症等疾病。
另一方面，考虑到体外环境的应用，可通过测定食物中的活性氧的种类及其浓度来观测食物的腐败状况。还可通过测定自来水及污水中的活性氧的种类及其浓度来观测水质污染情况。
此外，当添加含有过氧化物歧化酶(SOD)的样品时，可通过测定过氧化物阴离子自由基的灭活程度来测定该过氧化物阴离子自由基和过氧化物歧化酶的浓度，所述的过氧化物歧化酶是一种具有消除阴离子作用的酶。
实施例在下列参考例、实施例以及测试例中将更详细的描述本发明，但这些实施例不应视作对本发明的限定。
参考例15，10，15，20-四(3-噻吩基)卟啉(H2T3ThP)的合成将50ml丙酸、2.0ml 3-噻吩乙醛以及1.4ml吡咯装入一个100ml的圆底烧瓶。在搅拌该混合物的同时将其在160℃回流一小时。回流后，反应产物冷却至室温，再用冰块冷却，并加入200ml冷甲醇。将混合物抽滤。滤液用甲醇洗涤并采用硅胶色谱法(展开剂氯仿)纯化。将溶剂蒸干并对固体进行重结晶，然后在减压条件下干燥，从而获得黑色粉末晶体状的H2T3ThP(产量0.63g，19％)。该产物采用紫外-可见分光光度计(UV-2100，(株)岛津制作所制造)及1H-NMR鉴定。结果显示于表1和表2。
参考例25，10，15，20-四(2-氨基苯基)卟啉(H2T2AmP)的合成将500ml丙酸装入一个带有回流冷凝器的2L四颈烧瓶。加入25g 2-硝基苯甲醛后，在搅拌该混合物的同时对其进行加热并在110℃回流。加入12ml吡咯，并将混合物在沸点回流30分钟。在加入50ml氯仿之后，混合物用冰冷却并抽滤。滤液用400ml的氯仿洗涤，并在减压条件下干燥(100℃，6小时，0.1kPa)，从而得到黑紫色晶体状的前体5，10，15，20-四(2-硝基苯基)卟啉(H2T2NO2P)(产量5.0g，14％)。
将300ml的12N HCL装入一个2L的四颈烧瓶。在加入上述合成的5，10，15，20-四(2-硝基苯基)卟啉(H2T2NO2P)和20.0g二水合氯化锡(II)后，将混合物在65℃-70℃加热30分钟。逐步加入氨水并将混合物抽滤，滤液在减压条件下干燥。将滤液装入一个2L的大烧杯中，用10L丙酮萃取该滤液，用蒸发器将萃取物蒸发干燥。将干燥的固体溶解于2L的氯仿。溶液用氨水和离子交换水洗涤，并用无水硫酸钠脱水。用蒸发器将溶剂蒸发干燥，将固体物质重结晶并在减压条件下干燥，从而得到紫色晶体状的H2T3AmP(产量4.0g，90％)。以与参考例1中相同的方式，采用紫外-可见分光光度计(UV-2100，(株)岛津制作所制造)及1H-NMR鉴定产物。结果显示于表1及2。图7(a)显示的是H2T3ThP的紫外-可见光谱，图8(a)显示的是H2T3AmP的紫外-可见光谱。
(鉴定结果)表1卟啉 δH(CDCl3/TMS，ppm) -2.7(s，2H，吡咯-NH)7.7(t，4H，·噻吩-H)8.0(m，8H，噻吩-H)8.9(s，8H，吡咯-β-H) -2.7(s，2H，吡咯-NH)4.0(s，8H，氨基-H)7.0-7.7(m，16H，苯基-H)8.9(s，8H，吡咯-β-H)
(鉴定结果)表2λmax(nm)卟啉 索雷谱带 Q谱带H2T3ThP 422519 556 594 651FeT3ThP 425516H2T2AmP 420516 549 590 652Fe2T2AmP425493表1中H2T3ThP及H2T2AmP的鉴定结果证实了形成卟啉环的质子的峰，该峰是该卟啉化合物的特征峰。H2T2AmP的峰被证实在4.0ppm处，该峰值被认为是形成氨基的质子的峰。表2以及图7(a)和8(a)中的结果证实了基于H2T3ThP及H2T2AmP的紫外-可见光谱。上述结果证实在参考例1及2中合成得到了H2T3ThP及H2T2AmP。
参考例3金属卟啉络合物的合成(1)(通过金属化将中心金属(Fe)引入H2T3ThP)将10ml 48％的氢溴酸装入一个50ml的三颈烧瓶。在注入30分钟氮气后，加入100mg的还原铁。将混合物在100℃下搅拌直至还原铁溶解。搅拌后，将溶剂在减压条件下蒸发，从而获得白色粉末状的溴化铁酐。
将在参考例1中制备的250mg的卟啉(H2T3ThP)和200ml事先注入氮气达30分钟的二甲基甲酰胺(DMF)加入到所述产物中。将混合物在氮气氛围下反应4小时。反应后，将200ml氯仿加入到反应产物中。混合物用离子交换水洗涤，用无水硫酸钠脱水，并过滤。用蒸发器蒸发溶剂，采用氧化铝柱色谱法将所得固体纯化(展开剂氯仿/甲醇＝20/1)。在洗出液中加入48％的氢溴酸之后，用无水硫酸钠脱水并过滤。用蒸发器蒸发溶剂，使成为干燥固体，重结晶后减压干燥，从而获得黑色晶体状的金属卟啉(中心含Fe的H2T3ThP；下文称之为“FeT3ThP”)(产量230mg，84％)。
参考例4金属卟啉络合物的合成(2)(通过金属化将中心金属(Fe)引入H2T2AmP)除了采用250mg的H2T2AmP(在参考例2中获得)作为卟啉化合物以外，采用与参考例3中相同的方式获得在H2T2AmP的中心含Fe的金属卟啉络合物(下文称之为“FeT2AmP”)的黑色晶体(产量224mg，83％)。参考例3和4中的产物采用紫外-可见分光光度计鉴定。结果显示于图7、8及表2中。
图7(a)中显示了H2T3ThP的紫外-可见光谱，图7(b)中显示了FeT3ThP的紫外-可见光谱。图8(a)中显示了H2T2AmP的紫外-可见光谱，图8(b)中显示了FeT2AmP的紫外-可见光谱。表3显示的是检测紫外-可见光谱的结果。
中心不配位金属的卟啉化合物(H2T3ThP和H2T2AmP)具有一个基于共轭环的位于400nm附近的峰。该峰的分子消光系数为3.6-6.0×105M-1cm-1。该峰被称为索雷谱带。
此外，在可见光区域，卟啉化合物具有四个分子消光系数为104M-1cm-1、被称为Q谱带的峰。通常采用Q带的光谱变化来证实金属的引入。图7中的(a)与(b)比较结果以及表2表明，在图(a)中有四个Q谱带峰，在图(b)中峰的数目减少为1个。这一点与卟啉形成金属络合物时的典型行为相一致。因此，经证实，卟啉与铁形成了络合物，由此也就合成了金属卟啉络合物。
参考例5金属卟啉络合物的合成(3)(通过金属化将中心金属(Mn)引入H2T3ThP)在一个300ml的四颈烧瓶中装入100ml含有0.5g乙酸锰及在参考例1中制得的0.5g H2T3ThP的DMF，该四颈烧瓶可油浴加热并可用磁力搅拌器搅拌，而且装有上部带氩气球的回流冷凝器。将混合物用氩气饱和后，在140℃下回流1小时。
将得到的溶液倒入分液漏斗并用氯仿及离子交换水洗涤。在加入无水硫酸镁之后，将混合物脱水1小时并过滤。采用蒸发器将滤液蒸干。
采用柱色谱法分离并纯化干燥的固体(填充剂碱性氧化铝，洗脱液氯仿/甲醇＝20/1)。过滤后，将滤液蒸干。在减压条件下(0.1kPa，100℃)将固体干燥，得到黑紫色晶体状的MnT3ThP(产量0.36g)。
测定紫外线-可见吸收光谱来确证金属的引入。经证实，MnT3ThP的吸收峰位于380nm、405nm、480nm、533nm、583nm以及623nm，该结果与上述的H2T3ThP的情况不同。金属的引入因此得到验证。
参考例6具有轴向配体的金属卟啉络合物的合成(1)(1-甲基咪唑配位的FeT3ThP的合成)将参考例3中制得的FeT3ThP(0.018g)及1-甲基咪唑(2-100μl)(FeT3ThP1-甲基咪唑＝1-50(摩尔比))加入到0.5ml的二氯甲烷中。混合物在超声波(15W)照射下搅拌5分钟，或者在无超声波照射的情况下搅拌6小时或更长时间。
测定紫外-可见吸收光谱来确认配体的配位。由1-甲基咪唑向FeT3ThP配位而得到的络合物产生的吸收峰在421nm处，该结果与上述的FeT3ThP的情况不同。配体的配位据此得到确认。
采用蒸发器将络合物蒸干并保存，或者用于制备活性氧物质用电极。
实施例1活性氧物质用电极的制备(1)采用氧化铝抛光剂(0.05μg)将玻璃化炭黑(GC)电极(直径1.0mm，BSA有限公司制造)抛光。水洗后，再用甲醇洗涤电极。通过电解聚合反应，采用下列电解液和操作过程在该电极的表面形成聚合膜，从而制得其表面具有FeT3ThP聚合膜的玻璃化炭黑电极(本发明产品1)及表面具有FeT2AmP聚合膜的玻璃化炭黑电极(本发明产品2)。
(样品溶液)采用由参考例3或4中合成的FeT3ThP或FeT2AmP形成的浓度为0.05M的溶液作为金属卟啉络合物。采用含有作为支持电解质的0.1M高氯酸四丁铵(Bu4NClO4/TBAP)的(无水)二氯甲烷作为溶剂。使用氩气将溶剂中溶解的氧气除去。
(操作过程)采用具有如图1中所示构造的三电极电池(工作电极GC，对电极Pt线，参比电极SCE)，通过可逆电位扫描电解法进行电解聚合反应。在采用FeT3ThP制备活性氧物质用电极的情况下，扫描范围相对SCE为0到2.0V；在采用FeT2AmP制备活性氧物质用电极的情况下，扫描范围相对SCE为-0.2到1.4V。两种情况下的扫描速率均为0.05V/s。对于FeT3ThP，进行1次扫描，对于FeT2AmP，进行3次扫描。用X-Y记录仪(理研电子制造)记录该电解过程中得到的循环伏安图(CV曲线)。结果显示于图9和图10中。
图9显示的是采用FeT3ThP作为金属卟啉络合物来制备电极时电解聚合过程的CV曲线。根据该曲线，可认为在+1.74V(相对于SCE)时产生噻吩阳离子自由基。由于当逆转电位扫描时几乎没有因该阳离子自由基发生还原而造成的阴极电流流动，所以认为产生的阳离子自由基在溶液中立即发生了聚合。在0.6V附近(相对于SCE)的还原峰据认为是该聚合物的氧化还原响应。这些结果证实，在GC电极的表面形成了金属卟啉络合物聚合膜(FeT3ThP)。
图10显示的是采用FeT2AmP作为金属卟啉络合物来制备电极时电解聚合过程的CV曲线。根据该曲线，可认为在+1.02V(相对于SCE)时产生苯胺(氨基苯)阳离子自由基。由于当逆转电位扫描时几乎没有因该阳离子自由基发生还原而造成的阴极电流流动，所以认为产生的阳离子自由基在溶液中立即发生了聚合。在0.1V附近(相对于SCE)的还原峰据认为是该聚合物的氧化还原响应。在第二次扫描时发现了同样的峰。由此证实了聚合反应的进一步发展。在0.23V附近(相对于SCE)所观察到的氧化峰据认为是该聚合物的氧化还原响应。这些结果证实，在GC电极的表面形成了金属卟啉络合物聚合膜(FeT2AmP)。
实施例2活性氧物质用电极的制备(2)
采用仅有一端裸露且由聚醚醚酮(PEEK)环绕的玻璃化炭黑电极(GC)(PEEK的直径3mm，GC直径1mm，末端区域0.0079cm3；另一端由黄铜制造)。电极的GC端用6μm的抛光用金刚石及1um的抛光用金刚石依次抛光。在氧化铝抛光垫上采用氧化铝抛光剂(0.05μm)整饰抛光之后，用离子交换水及丙酮洗涤电极。
将0.0037g在参考例4中制备的FeT2AmP和0.171g的TBAP加入5ml的量瓶中。向混合物中加入乙腈使总体积达到5ml，从而得到样品溶液。
将样品溶液加入电池小管。用GC电极作为工作电极，装配一个如图1所示的三电极电化学电池。采用氩气置换气氛。
在电位扫描范围相对Ag/Ag+为-0.3到1.0V、电位扫描速率为200mV/秒的条件下进行三次电位扫描。扫描的初始电位和终点电位相对Ag/Ag+为0V。首先以逆向的形式进行扫描。扫描后，用乙腈和离子交换水依次洗涤该电池，从而制得表面上形成有FeT2AmP聚合膜的玻璃化炭黑电极(本发明产品3)。
实施例3活性氧物质用电极的制备(3)将0.171g的TBAP加入5ml的量瓶中。向其中加入二氯甲烷使总体积达到5ml，从而得到电解液。
将样品管的由硼硅酸盐耐热玻璃密封的端部浸入所述电解液中，同时将0.0182g在参考例4中制备的FeT2AmP和0.0171g的TBAP以及0.5ml的二氯甲烷加入该样品管。
将实施例2中使用的Pt对电极和GC电极放入样品管，并将Ag/Ag+电极如图2中所示放置于样品管的外侧，以此制造两室三电极电化学电池。采用氩气置换这两室中的气氛。
在电位扫描范围相对Ag/Ag+为-0.3到2.5V、电位扫描速率为50mV/秒的条件下进行三次电位扫描。扫描的初始电位相对Ag/Ag+为0V，终点电位相对Ag/Ag+为-0.3V。首先从负向开始进行扫描。扫描后，用二氯甲烷和离子交换水依次洗涤该电池，从而制得表面上形成有FeT2AmP聚合膜的玻璃化炭黑电极(本发明产品4)。
实施例4活性氧物质用电极的制备(4)将玻璃化炭黑电极柱(直径0.28-0.30mm)引入玻璃毛细管中(内径0.3mm)。将这些制品引入针(由铂或不锈钢等制成，大致相当于18G注射针)中。用环氧粘合剂、丙烯酸粘合剂或修剪粘合剂等将这些制品接合并固定。接着，通过如银糊或碳糊等导电性粘合剂，分别将玻璃化炭黑和外侧的针与铂电极、不锈钢电极或铜电极等电极接合。端部采用磨光机抛光，从而制得如图3中所示的具有三层结构的针型电极(玻璃化炭黑工作电极；内部玻璃毛细管工作电极和对电极之间的绝缘部分；外侧的针对电极)。
将采用与实施例3中相同的方法制得的电解液(5ml)加入电池容器中。将含有0.0171g的TBAP的FeT3ThP的二氯甲烷溶液加入到样品管中，所述FeT3ThP是在参考例6中制得的，并配位有1-甲基咪唑，将样品管的由硼硅酸盐耐热玻璃密封的端部浸入电解液中。
将上述制备的针型电极(工作电极和对电极)放入样品管，并将Ag/Ag+电极如图3所示放置于样品管的外侧，从而制得两室三电极电池。
采用可逆电位扫描法(电位扫描范围相对Ag/Ag+为-0.1～+2.0V、电位扫描速率10～500mV/秒)以及恒电位法(电位相对Ag/Ag+为+2.0V)使该电池电解聚合5～120分钟。电解聚合后，用二氯甲烷及离子交换水洗涤该电池，从而制得具有三层结构的针型电极，其中包括表面具有1-甲基咪唑配位的FeT3ThP的聚合膜的玻璃化炭黑电极(由聚合膜表面修饰的玻璃化炭黑工作电极；内部玻璃毛细管工作电极与对电极之间的绝缘部分；外侧的针对电极；本发明产品5)。
比较例1细胞色素C固定化金电极的制备。
作为本发明产品的电极的比较产品，以下列方法制备了细胞色素C固定化金电极作为测定过氧化物阴离子自由基浓度用的电极。
采用氧化铝抛光剂(0.05μm)将金电极(直径1.6mm，BSA有限公司生产)抛光并用水清洗。将电极用1M H2SO4进行电化学处理，然后用水清洗。接着，将电极在10mM 3-巯基丙酸(在下文中缩写为MPA，AldrichCo.生产)(溶剂10mM磷酸缓冲液(pH7.0))中浸渍24小时，以获得MPA修饰的金电极。用水洗涤电极后，在0.48mM细胞色素C(IV型，取自马心，Sigma Co.生产)(溶剂10mM磷酸缓冲液(pH7.0))中进行电位扫描30分钟(扫描范围为-0.4到0.4V(相对Ag/AgCl)，扫描速率0.05V/s)。加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC，Pierce Chemical Co.生产)使其最终浓度为0.5M，并将电极在该混合物中浸渍2小时。最后用磷酸缓冲液洗涤电极，得到细胞色素C固定化金电极(比较产品1)。上述磷酸缓冲液是磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合物溶液。采用经过单次蒸馏的水调节样品溶液。
试验例1过氧化物阴离子自由基的量的测定(1)采用本发明产品1与比较产品1测定过氧化物阴离子自由基的量。
首先，将作为工作电极的本发明产品1的电极或比较产品1的电极和作为对电极的Pt电极置于电池容器，采用银/氯化银电极(Ag/AgCl)作为参比电极，形成一个检测用的三电极电池。将检测用的三电极电池放在中心，制备如图5所示的装置。在该检测过程中，将比较产品1电极的电位扫描范围设定为-0.2到0.25V(相对Ag/AgCl)，将本发明产品1的电极的电位扫描范围设定为-0.5到0.5V(相对Ag/AgCl)。采用多个扫描速率进行测定。
制备含有14.4mM黄嘌呤(Sigma Co.生产)的2mM的氢氧化钾水溶液及含有10mM氯化钾的10mM Tris缓冲液(pH7.5)。取0.365ml前者及14.635ml后者混合，制备0.35mM的黄嘌呤溶液，作为检测液使用。采用高纯度的氩气去除检测液中溶解的氧气。
其次，将检测液加入试验用的三电极电池中。采用足以高出每个电极的氧化-还原电位的0.2V(相对Ag/AgCl)的电位。将黄嘌呤氧化酶(XOD，来源于酪乳的Grade III，Sigma Co.生产)加入到检测液，使其最终浓度为0-100mU/ml。记录氧化电流随时间的变化。本发明产品1的结果显示于图12，比较产品1的结果显示于图11。在使用前，将XOD用10ml的磷酸缓冲液(pH7.0)透析。所有的测定均在室温下进行。
将XOD加入黄嘌呤中，依赖于剂量地生成过氧化物阴离子自由基。图11显示了在作为对照的比较产品1中加入XOD的过程中，氧化电流随时间的变化，该图表明，在加入XOD之后，氧化电流立即迅速增加，而后几乎保持恒定值。图12显示了在本发明产品1中加入XOD的过程中，氧化电流随时间的变化，该图表明，在加入XOD之后，与图11一样，氧化电流立即迅速增加，该电流一度有所减少，而后几乎保持恒定值，而且该电流值依赖于XOD的浓度，尤其是依赖于过氧化物阴离子自由基的量。
图13是表示(XOD活度)1/2与在本发明产品1和比较产品1中添加XOD时的电流增加量之间的关系图。XOD活度的测定考虑了Fridovich等人和Cooper等人的文献中的文献值(J.M.McCord和I.Fridovich，J.Boil.Chem.，243，5753(1968)；J.M.McCord和I.Fridovich，J.Boil.Chem.，244，6049(1969)；I.Fridovich，J.Boil.Chem.，245，4503(1970)；以及J.M.Cooper，K.R.greenough和C.J.McNeil，J.Electroanal.Chem.，347，267(1993))。
结果显示，在本发明产品1中电流增加量与(XOD活度)1/2成正比，二者之间的线性关系与用作对照的比较产品1相同。这些事实证明，可采用本发明的活性氧物质用电极来测定过氧化物阴离子自由基的浓度。
试验例2过氧化物阴离子自由基的量的测定(2)采用本发明产品5的电极来测定过氧化物阴离子自由基的量。
采用双电极方法检测本发明产品5的电极，具体地说，是具有三层结构的针型电极(由聚合膜作表面修饰的玻璃化炭黑工作电极；内部玻璃毛细管位于工作电极与对电极之间的绝缘部分；外侧的针对电极；本发明产品5)。采用含有0.15mM黄嘌呤的Tris缓冲液(pH7.5)作为检测液。在该溶液中加入0-100mU/ml的XOD。外加电压为0-1.0V。
图14中显示了，在外加电压为+0.5V的条件下，当加入的XOD的浓度达到100mU/ml时，电流随时间的变化。根据峰电流值得到的过氧化物阴离子自由基的量与电流的变化量的关系图显示于图15。由图15测定的过氧化物阴离子自由基的量与电流的变化量之间的相关系数为0.995。这表明，本发明的电极可有效地用于测定过氧化物阴离子自由基的量。
工业实用性本发明的活性氧物质用电极可在包括体内环境及体外环境的任何环境下，检测如过氧化物阴离子自由基、过氧化氢和·OH等活性氧物质及其它活性自由基物质(NO、ONOO-等等)。另外，可通过将该电极与对电极或参比电极结合使用，来定量测定这些活性氧物质以及其它活性自由基物质。因而该电极可广泛应用于各种领域。
例如，如果在体内使用，可根据活体内的活性氧物质以及其它活性自由基物质来精确确定各种疾病。
另一方面，如果在体外使用，可对食物中的活性氧物质种类及其浓度进行测定，根据测定结果来判断食物的腐败状况。还可通过测定自来水及污水中的活性氧物质种类及其浓度，来观测水质污染状况。
权利要求
1.活性氧物质用电极，该电极具有表面形成了金属卟啉络合物聚合膜的导电元件。
2.根据权利要求1所述的电极，其中，所述的金属卟啉络合物是由以下式(I)或(II)表示的化合物，所述的式(I)是 其中，M是选自由铁、锰、钴、铬和铱组成的组中的一种金属，四个R中至少一个为选自由以下基团组成的组中的基团硫代呋喃基、吡咯基、呋喃基、巯基苯基、氨基苯基和羟基苯基，其他R代表这些基团中的任一基团、烷基、芳基或氢；所述式(II)是 其中，M及R与上述限定的相同，两个L中至少一个是含氮的轴向配体，例如咪唑及其衍生物、吡啶及其衍生物、苯胺及其衍生物、组氨酸及其衍生物以及三甲胺及其衍生物；含硫的轴向配体，例如苯硫酚及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物以及甲硫氨酸及其衍生物；或者含氧的轴向配体，例如苯甲酸及其衍生物、乙酸及其衍生物、苯酚及其衍生物、脂肪醇及其衍生物以及水；另一个L是这些轴向配体中的任一配体或者不带配体的基团。
3.根据权利要求1或2所述的电极，其中，形成所述金属卟啉络合物的卟啉化合物选自由以下化合物组成的组5，10，15，20-四(2-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-羟基苯基)卟啉、[5，10，15-三(2-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、[5，10，15-三(3-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、[5，10-二(2-硫代呋喃基)-15，20-双苯基]卟啉、[5，10-二(3-硫代呋喃基)-15，20-双苯基]卟啉、[5，15-二(2-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5，1 5-二(3-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5-单(2-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉以及[5-单(3-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉。
4.测定活性氧物质的浓度用的传感器，该传感器具有活性氧物质用电极、对电极和参比电极，所述活性氧物质用电极具有表面形成了金属卟啉络合物聚合膜的导电元件。
5.根据权利要求4所述的传感器，其中，所述金属卟啉络合物是由以下式(I)或(II)表示的化合物，所述的式(I)是 其中，M是选自由铁、锰、钴、铬和铱组成的组中的一种金属，四个R中至少一个是选自由以下基团组成的组中的基团硫代呋喃基、吡咯基、呋喃基、巯基苯基、氨基苯基以及羟基苯基，其他R代表这些基团中的任一基团、烷基、芳基或氢；所述式(II)是 其中，M及R与所述式(I)中限定的相同，两个L中至少一个是含氮的轴向配体，例如咪唑及其衍生物、吡啶及其衍生物、苯胺及其衍生物、组氨酸及其衍生物以及三甲胺及其衍生物；含硫的轴向配体，例如苯硫酚及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物以及甲硫氨酸及其衍生物；或者含氧的轴向配体，例如苯甲酸及其衍生物、乙酸及其衍生物、苯酚及其衍生物、脂肪醇及其衍生物以及水；另一个L是这些轴向配体中的任一配体或者不带配体的基团。
6.根据权利要求4或5所述的传感器，其中，形成所述金属卟啉络合物的卟啉化合物选自由以下化合物组成的组5，10，1 5，20-四(2-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-吡咯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(2-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-巯基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(2-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(3-羟基苯基)卟啉、5，10，15，20-四(4-羟基苯基)卟啉、[5，10，15-三(2-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、[5，10，15-三(3-硫代呋喃基)-20-单苯基]卟啉、[5，10-二(2-硫代呋喃基)-15，20-双苯基]卟啉、[5，10-二(3-硫代呋喃基)-15，20-双苯基]卟啉、[5，15-二(2-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5，15-二(3-硫代呋喃基)-10，20-双苯基]卟啉、[5-单(2-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉以及[5-单(3-硫代呋喃基)-10，15，20-三苯基]卟啉。
7.检测样品中活性氧物质的方法，该方法包括以下步骤使用权利要求4～6中任一项所述的传感器来测定金属卟啉络合物聚合膜中的金属与活性氧物质之间的氧化还原反应所产生的电流。
全文摘要
本发明提供了一种活性氧物质用电极，其特征在于，它具有一个导电元件，该导电元件上具有由金属卟啉制得的聚合膜。该活性氧物质用电极可在体内及体外条件下检测活性氧物质，如过氧化物阴离子自由基、过氧化氢或·OH及其它活性自由基物质(NO、ONOO
文档编号G01N27/49GK1605026SQ0282541
公开日2005年4月6日 申请日期2002年12月19日 优先权日2001年12月20日
发明者汤浅真, 阿部正彦, 山口有朋, 盐泽麻子, 石川满寿英, 江口胜哉, 木户茂 申请人:武林敬, 汤浅真, 阿部正彦