专利名称：可用于非标记检测的固相化核酸探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种固相化核酸探针，尤其涉及可用于非标记检测的固相化核酸探针。
背景技术：
随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。核酸序列信息的高通量检测和分析技术将成为医学等生命科学领域的核心技术之一。近来，基因芯片技术越来越受到人们的重视。但是，目前基因芯片技术尚存在一些问题，影响其在生物学和医学临床中的应用。1)检测过程复杂。提取的样品DNA需要进行扩增，并掺入荧光标记物。在这个过程中很容易产生样品间的交叉污染，影响检测的可靠性。2)由于荧光标记物的掺入不仅复杂，而且使用成本高，不利于基因芯片在临床诊断中的推广应用。人们需要发展高通量、准确、低成本、非标记的基因信息检测方法。目前非标记检测技术主要包括一些探针，如TaqMan探针，分子信标探针，用于荧光定量PCR反应，这些液相环境下技术最大的劣势在于它们的低通量能力，不能用于同时检测多个目标序列。
发明内容
1、技术问题本发明提供一种对被测基因可进行高通量检测、使用成本低的可用于非标记检测的固相化核酸探针。
2、技术方案一种可用于非标记检测的固相化核酸探针，包括固体载体1，在固体载体1上固定包含有荧光基团2、荧光淬灭基团3和特异性核酸识别序列片断4的寡核苷酸探针，该探针中荧光基团2和荧光淬灭基团3的相对物理位置为能使荧光淬灭位置；当靶基因与寡核苷酸探针中特异性核酸识别序列片断杂交后，通过生化反应，使寡核苷酸探针上的荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而使核酸探针发射荧光。
3、技术效果本发明提出的固相化核酸探针，即在核酸探针上包含一段与被测的靶基因可相互识别的核酸序列，以及在物理位置上相近的荧光基团和荧光淬灭基团。在正常的状态下，荧光淬灭基团可有效地使相邻的荧光基团的荧光淬灭，探针不发射荧光。但当被检测的靶基因与探针识别之后，在生物活性酶的作用下，把荧光淬灭基团从探针上切除，使探针发出荧光，从而实现被测核酸序列的非标记检测。把可针对不同被测核酸序列的探针集成在一起，即构成微阵列芯片，本发明具有以下优点a.探针可通过不同形式直接固定在固体载体上，形成高密度的微阵列芯片，利用空间分辩来区分不同的检测位点，从而实现高通量并行检测。避免了现有定量PCR仪器中荧光染料的选择受限于激发波长范围的问题；b.由于核酸探针中荧光淬灭基团的切除是通过生化反应实现的，对于没有与靶分子杂交的探针，荧光分子基团为淬灭分子基团所淬灭，因此整个芯片的荧光背景很低，检测的灵敏度高；c.克服了现有的多重PCR荧光标记靶序列的技术难题，可实现实时、高通量的非标记检测，同时，没有PCR过程，大大减少了检测所需的时间，也降低了芯片的使用难度和成本；d.无需对靶基因进行荧光标记，可大大地简化的操作过程，节约使用的成本，并可进行靶基因的定量检测；e.通过构建微流体芯片，可有实现整个检测过程的自动化。
四
图1是本发明提出的固相化核酸探针的三种结构示意图。图1是荧光基团和淬灭基团在两条互补链上的固相化核酸探针，图1(B)荧光基团和淬灭基团在同一条互补链上的固相化核酸探针，图1(C)简接法通过杂交制备的固相化核酸探针。
图2是本发明图1(A)所述固相化核酸探针在exonuclease I存在下的工作示意图。
图3是本发明提出的第一种固相化核酸探针在5’-nuclease存在下的工作示意图。
图4是本发明提出的第三种固相化核酸探针在5’-nuclease存在下的工作示意图。
图5是本发明提出的第二种固相化核酸探针在内切酶存在下的工作示意图。
图6是本发明提出的第二种固相化核酸探针在5’-nuclease存在下的工作示意图。
图7是本发明提出的硫代碱基修饰的固相化核酸探针在5’-nuclease存在下的工作示意图。
五具体实施例方式实施例一本发明提出的固相化核酸探针包括荧光发色基团和荧光淬灭基团杂交双链构成的两个突出端，在双链中间通过一个手臂分子固定在固体基片上。靶序列能够与探针的一条突出端上的特异性序列互补时形成完整的双链。在E.coliexonucleaseI作用下，另一条单链突出端连同淬灭分子被切除，荧光发色基团在激发下能发射荧光信号。而非特异性靶序列存在时，由于靶序列无法与探针上的特异性序列杂交。E.coli exonuclease I无法识别、切除另一条单链突出端，使双链保持完整，荧光信号依然被淬灭，没有荧光信号释放(图2)。
设计九条特异性固相化核酸探针，通过接触式点样法制备微阵列芯片，分别成功地检测了人的抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene)中4，18，12，17，19，44，45，48，51外显子的缺失。
实施例二应用实施例一制备好的微阵列芯片，加入包含有靶基因的生物样品溶液，以及DNA聚合酶(Taq polymerase)，缓冲液，Mg2+或Mn2+，dNTP等，盖上疏水化的盖玻片或原位杂交膜片后，置于PCR仪内在合适的温度、时间等反应条件下进行反应。反应结束后用仪器的激发波长周期性采集芯片的荧光信号，通过MilliQH2O洗涤玻片，N2吹干后用荧光扫描仪给出荧光信号的强度。
通过荧光定量PCR程序，如95℃ 10min；95℃ 30sec，60℃ 1min，72℃ 30sec；40cycles。在每个延伸反应后期检测一次芯片的荧光信号(图3)，分析荧光信号的增加曲线，可以获得样品中靶基因的量。
实施例三本发明提出的另一种固相化核酸探针包括荧光发色基团和荧光淬灭基团，特异性核酸序列区、非特异性间隔区以及手臂分子区。探针经与固相支持物连接后形成微阵列芯片。用适当方法固定探针，0.1％ SDS洗涤5min，之后用硼氢化钠封闭，再用MilliQ H2O洗涤玻片，N2吹干。4℃黑暗保存备用或直接使用。
针对E.coli O157H7中uid基因在92位置上的G/C突变，设计了三条相应的探针，包括一条阴性对照，在报告分子和淬灭分子包括一个特异性限制性内切酶位点。当野生型靶序列存在时，内切酶不能识别，不发生酶切反应；当突变型靶序列存在时，内切酶识别后与双链结合，发生酶切反应把淬灭分子切离报告分子，荧光信号释放出来(图5)。设计针对E.coli O157H7中的毒力因子如rfbE、flicH7、hlyA等探针，当这些相应的靶序列存在时，在Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性的作用下，淬灭分子被切除，荧光信号释放出来(图6)。
实施例四本发明提出的固相化核酸探针包括荧光发色基团和荧光淬灭基团，可以固定在微球或微珠上(microparticles or microbeads)构成悬浮式微阵列。每个微球或微珠上可组合式固定不同荧光发色基团标记的核酸探针，通过特定激发波长组合编码来完成多个位点在单个反应管内的即时检测。设计针对E.coliO157H7中的毒力因子如rfbE、flicH7、hlyA等特异性探针，当这些相应的靶序列存在时，在5’外切酶活性的作用下，随着相应核酸链的置换反应的进行，淬灭分子被切除，荧光信号释放出来。分析检测所得的荧光信号可以给出相应的靶序列存在信息。
实施例五本发明提出的固相化核酸探针是由二条部分序列互补匹配的寡核酸链组成的，其中一条链包括荧光发色基团和荧光淬灭基团，并在这二个基团之间设置一个硫代碱基，以阻止酶切。由于荧光发色基团和荧光淬灭基团的物理距离较小，该分子无荧光发射。另一条链包含有可固定于基底的化学基团(如氨基)和可与靶基因和第一条链特异性杂交的DNA片断组成。靶序列能够与探针的特异性序列互补形成双链，并在5’nuclease作用下进行延伸，并把该探针上杂交的另一条单链DNA碱基逐个切除，当淬灭分子被切除，荧光发色基团在激发下能发射荧光信号。当5’nuclease延伸至杂交链上的硫代碱基时，生化反应中止。而对于非特异性靶序列存在时，由于靶序列无法与探针上的特异性序列杂交。5’nuclease无法识别、切除另一条单链突出端，使双链保持完整，荧光信号依然被淬灭，没有荧光信号释放(图7)。
设计九条特异性固相化核酸探针，通过接触式点样法制备微阵列芯片，分别成功地检测了人的抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene)中4，18，12，17，19，44，45，48，51外显子的缺失。
实施例六本发明是一种可用于非标记检测的固相化核酸探针，包括固体载体1，在固体载体1上固定包含有荧光基团2、荧光淬灭基团3和特异性核酸识别序列片断4的寡核苷酸探针，该探针中荧光基团2和荧光淬灭基团3的相对物理位置为能使荧光淬灭位置，当靶基因与寡核苷酸探针中特异性核酸识别序列片断杂交后，通过生化反应，使寡核苷酸探针上的荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而使核酸探针发射荧光，在本实施例中，特异性核酸识别序列片断4、荧光基团2、荧光淬灭基团3以及用于固定该核酸探针的位点，位于同一条寡核苷酸探针上，特异性核酸识别序列片断靠近探针的5’端，荧光基团靠近寡核苷酸探针的3’端，在荧光基团2和荧光淬灭基团3之间设有核酸内切位点5，寡核苷酸探针按微阵列分布在固体载体1，本实施例把固有不同特异性核酸识别序列片断的探针的固体载体放在同一溶液中，制备成悬浮式微阵列。
实施例七本发明是一种可用于非标记检测的固相化核酸探针，包括固体载体1，其特征在于在固体载体1上固定包含有荧光基团2、荧光淬灭基团3和特异性核酸识别序列片断4的寡核苷酸探针，该探针中荧光基团2和荧光淬灭基团3的相对物理位置为能使荧光淬灭位置，当靶基因与寡核苷酸探针中特异性核酸识别序列片断杂交后，通过生化反应，使寡核苷酸探针上的荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而使核酸探针发射荧光，在本实施例中，荧光基团2、荧光淬灭基团3在寡核苷酸探针的互补链上，寡核苷酸探针的互补链通过分子识别反应结合在寡核苷酸探针上，在荧光淬灭基团与荧光基团的碱基之间有阻止酶作用的修饰6，本实施例把固有不同特异性核酸识别序列片断的探针的固体载体放在同一溶液中，制备成悬浮式微阵列。
本发明采用的制备方法如下(a)将化学合成的标记荧光寡核苷酸探针通过共价键结合或物理吸附连接到固相载体上。该探针包括一个或多个荧光分子基团和一个或多个淬灭分子基团，两者保持在10-100的物理距离，由于能量传递或电子云重叠的作用，荧光分子基团的荧光信号被淬灭分子基团所淬灭；(b)固定的标记探针，可以是单链、双链等多种形式，并可构成微阵列芯片；(c)当所在的体系中与探针互补的靶序列与探针上的互补序列杂交后，通过生化反应，如结构特异性生物酶的酶切作用，或DNA聚合酶的外切活性，淬灭分子基团被切离探针分子；(d)荧光分子基团由于与淬灭分子基团的物理距离改变，可激发出荧光信号，通过荧光检测器能够获得荧光信号，进而获得样品中的基因信息。本发明采用的制备方法如下(a)将化学合成的标记荧光寡核苷酸探针通过共价键结合或物理吸附连接到固相载体上。该探针包括一个或多个荧光分子基团和一个或多个淬灭分子基团，两者保持在10-100的物理距离，由于能量传递或电子云重叠的作用，荧光分子基团的荧光信号被淬灭分子基团所淬灭；(b)固定的标记探针，可以是单链、双链等多种形式，并可构成微阵列芯片；(c)当所在的体系中与探针互补的靶序列与探针上的互补序列杂交后，通过生化反应，如结构特异性生物酶的酶切作用，或DNA聚合酶的外切活性，淬灭分子基团被切离探针分子；(d)荧光分子基团由于与淬灭分子基团的物理距离改变，可激发出荧光信号，通过荧光检测器能够获得荧光信号，进而获得样品中的基因信息。
固体支持物的准备用做固定本发明固相化核酸探针的固相支持物可以多种形式的固相载体，如微粒、微球、凝胶、固体片状或薄膜等。材料的表面具有活性化学基团，如胺基、醛基等，以便与各类生物分子相连接；良好的光学性质，如较低的荧光背景；以及材料的稳定性好等。玻璃片(glass slides)、塑料如聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、或聚碳酸酯(polycarbonate)等。
固相支持物的活化与合成用活化试剂通过化学反应在载体的表面键合上活性基团，以便与相应的配基共价结合，形成具有不同的生物特异性的亲和载体，用来固定不同的核酸探针。
固相化核酸探针的制备采用商业化固相化学合成方法合成设计好的包含有二个或二个以上的荧光发色基团和荧光淬灭基团和特异性核酸序列的寡核苷酸探针。
探针的固定固相化学合成好的探针通过机器、手工或电泳等方式转移到固相支持物表面，在适当条件下与固体支持物连接。
杂交和检测在被测体系中加入适当的离子、和缓冲液等，靶基因与本发明的固相化探针进行杂交反应、酶切反应或扩增反应。调节各个反应的温度和时间，对相应的反应体系进行荧光信号的检测，通过计算机控制与相应软件分析其结果，得到被检测的基因信息。
权利要求
1.一种可用于非标记检测的固相化核酸探针，包括固体载体(1)，其特征在于在固体载体(1)上固定包含有荧光基团(2)、荧光淬灭基团(3)和特异性核酸识别序列片断(4)的寡核苷酸探针，该探针中荧光基团(2)和荧光淬灭基团(3)的相对物理位置为能使荧光淬灭位置；当靶基因与寡核苷酸探针中特异性核酸识别序列片断杂交后，通过生化反应，使寡核苷酸探针上的荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而使核酸探针发射荧光。
2.根据权利要求1所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于特异性核酸识别序列片断(4)、荧光基团(2)、荧光淬灭基团(3)以及用于固定该核酸探针的位点，位于同一条寡核苷酸探针上。
3.根据权利要求1或2所述可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于特异性核酸识别序列片断靠近探针的5’端，荧光基团靠近寡核苷酸探针的3’端。
4.根据权利要求1所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于在荧光基团(2)和荧光淬灭基团(3)之间设有核酸内切位点(5)。
5.根据权利要求1所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于荧光基团(2)、荧光淬灭基团(3)在寡核苷酸探针的互补链上，寡核苷酸探针的互补链通过分子识别反应结合在寡核苷酸探针上。
6.根据权利要求5所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于在荧光淬灭基团与荧光基团的碱基之间有阻止酶作用的修饰(6)。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于寡核苷酸探针按微阵列分布在固体载体(1)。
8.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的可用于非标记检测的固相化核酸探针，其特征在于把固有不同特异性核酸识别序列片断的探针的固体载体放在同一溶液中，制备成悬浮式微阵列。
全文摘要
本发明公开了一种可用于非标记检测的固相化核酸探针，包括固体载体，在固体载体上固定包含有荧光基团、荧光淬灭基团和特异性核酸识别序列片断的寡核苷酸探针，该探针中荧光基团和荧光淬灭基团的相对物理位置为能使荧光淬灭位置；当靶基因与寡核苷酸探针中特异性核酸识别序列片断杂交后，通过生化反应，使寡核苷酸探针上的荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而使核酸探针发射荧光。本发明利用物理空间位置克服了现有检测器荧光染料种类的选择受限于激发波长范围的问题；避免了现有的多重PCR荧光标记靶序列的技术难题；可实现了样本高通量、非标记的自动化检测。大大减少了检测所需的时间；具有实现微全分析的潜力。
文档编号G01N33/68GK1434286SQ0311291
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者陆祖宏, 刘和平, 王宏 申请人:东南大学