专利名称：一种检测sars病毒抗体的试剂盒，其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测SARS病毒抗体的试剂盒，还涉及其制备方法及用途。
根据抗原抗体反应的不同安排，荧光抗体技术有下列三种方法。
(一)直接法这是荧光抗体技术基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本上，一定时间后，用缓冲液充分冲洗，然后在显微镜下观察。若有相应的抗原存在。即与荧光标记的抗体结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。本法优点是特异性高，受非特异荧光干少。缺点是每检查一种抗原，必须制备与其相应的荧光标记抗体，且灵敏度较低。
(二)间接法系根据抗球蛋白试验的原理。用荧光色素标记抗球蛋白抗体(或称抗抗体)。试验过程分为两部第一步，将未标记的抗体加到有抗原的标本片上，作用一定时间后，洗去未结合的抗体；第二步，加入荧光素标记的抗球蛋白抗体，如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体分子(已知的未标记的)发生结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物。本法的优点是灵敏度高于直接法，而且只需制备一种荧光色素标记的抗球蛋白抗体，即可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统，可用来检测抗原和抗体。
(三)补体法这是间接荧光抗体法的一种变型。系利用补体结合反应的原理，用荧光色素标记抗补体抗体(常用抗豚鼠补体C3的荧光抗体)。试验过程也可分为两步第一步，将未标记的抗体和补体加到抗原标本片上，作用一定时间后，洗去游离的抗体和补体；第二步，加上荧光色素标记的抗补体抗体，如果在第一步中抗原抗体发生特异的结合，则补体被固定，此时加入标记的抗补体抗体，即与补体发生结合，形成抗原—抗体—补体—标记的抗补体抗体的大分子免疫复合物。
本发明中的SARS病毒是指严重急性呼吸系统综合征(SARS)的病原体，它是最近出现的一种新病毒，为冠状病毒的变种，与已知的冠状病毒基因序列的同源性约为60％，但在抗原性上二者没有交叉。所以虽然正常人群中存在已知的冠状病毒的抗体，但对此种病毒却没有保护作用，导致人群的普遍易感。此病毒引发严重的呼吸系统疾病，病死率目前在5％左右，严重危害人类的健康，世界卫生组织将其定义为严重急性呼吸系统综合征，我国称之为“非典型肺炎”。目前在世界数十个国家已经发现了此病，感染人数达数千人，并有继续蔓延的趋势。因此快速检测SARS病毒感染的方法对于SARS的诊断，控制疾病的蔓延有重要意义。
到目前为此，尚无间接免疫荧光技术用于检测SARS病毒感染的报道。
本发明提供的试剂盒包含以下内容SARS病毒感染细胞抗原片SARS病毒抗体阳性对照正常人血清阴性对照抗人荧光素标记抗体荧光抗体稀释液标本血清稀释液试剂盒使用说明书本发明公开的试剂盒系用正常Vero E6细胞感染SARS病毒经培养后，将感染细胞固定在10孔镀膜玻片后制成抗原片，采用间接免疫荧光法原理检测人血清标本中SARS病毒抗体。其中SARS病毒为严重急性呼吸系统综合征(SARS)的病原体，为一种或多种新的冠状病毒；抗人荧光素标记抗体为抗人IgG抗体或抗人IgMμ链抗体；SARS病毒抗体为抗SARS病毒IgG抗体或IgM抗体。
本发明中各成分的含量可根据实际需要加减，检测一定人份数的标本。如SARS病毒感染细胞抗原片5张，SARS病毒抗体阳性对照100μl，正常人血清阴性对照100μl，抗人荧光素标记抗体30μl(抗人IgG抗体)或40μl(抗人IgMμ链抗体)，荧光抗体稀释液1000μl，标本血清稀释液2000μl可检测20人份的血清标本。
本发明的另一个目的是提供该试剂盒的制备方法。
试剂盒中各成分的制备方法如下SARS病毒感染细胞抗原片将SARS病毒感染的细胞培养液稀释并接种Vero E6细胞，吸附后加入维持液培养。显微镜下观察CPE，当有细胞出现CPE时，制成细胞悬液。
将细胞悬液滴加在镀膜玻片上，培养后漂洗去除悬浮细胞，晾干。-20℃丙酮固定后晾干、密封，-20℃冻存。
SARS病毒抗体阳性对照血清选用经灭活处理后的10份SARS病毒IgG或IgM抗体阳性血清混合，按适当的比例稀释阳性血清并混匀，-20℃冻存。
正常人血清阴性对照选用经灭活处理后的10份SARS病毒抗体阴性血清混匀后，按适当的比例稀释阴性血清，-20℃冻存。
抗人荧光标记抗体FITC荧光素标记用抗人IgG或IgMμ链抗体经检定合格后，采用直接法进行荧光素标记，然后将FITC标记抗体进行纯化，并进行浓度选择。
荧光抗体稀释液采用伊文思兰，加入蒸馏水配制。
标本血清稀释液为PBS溶液。
SARS病毒抗体免疫荧光检测试剂盒使用说明书。(详见实施例)将上述各成分装于外包装盒中，组成整个试剂盒。
本发明中的试剂盒的制备按中国《药品生产质量管理规范》要求实施，具有阳性血清处理、分装的隔离实验室。
本发明公开的原料及辅料符合现行《中国生物制品主要原辅料质控标准》要求，未纳入上述标准的化学试剂，不低于分析纯。
本发明还有一个目的，就是公开该试剂盒在检测人血清中SARS病毒抗体上的应用。通过一百余例的临床病例检测，本发明的试剂盒检测时间短，使用方便，灵敏度高、特异性好，易于保存。在SARS病毒的检测上，具有良好的市场前景和社会效益。
图2为SARS病毒感染细胞间接免疫荧光法染色结果，图中的细胞胞浆内形态特异的白色部分(实际观察中为黄绿色)即为荧光素标记抗体的特异染色部位。
试剂盒使用说明书 1份外包装盒 1个实施例 SARS病毒抗体免疫荧光检测试剂盒的制备一、SARS病毒感染细胞抗原片的制备SARS病毒从广州非典型肺炎病人尸解肺组织中新分离的SARS病毒GZ1株。
SARS病毒鉴定采用细胞培养和乳鼠接种法，从非典型肺炎病例标本中分离致病病原体，通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及RT-PCR扩增、基因序列分析对分离的病原体进行鉴定。
细胞为Vero E6细胞，经无菌检测合格后使用。
10孔镀膜玻片经处理并检定合格后使用。
首先制备SARS病毒感染细胞悬液将SARS病毒感染的细胞培养液稀释为10-2，取1.0毫升接种Vero E6细胞37℃吸附1h后加入维持液，37℃培养。显微镜下观察CPE，当有25％细胞出现CPE时，制成细胞悬液，细胞浓度为107个/ml。
将细胞悬液滴加在镀膜玻片上20μl/孔，37℃培养6h，用PBS漂洗去除悬浮细胞，晾干，-20℃丙酮固定4h后晾干、密封，-20℃冻存备用。
抗原片每孔应均有细胞，无漏空，细胞分布均匀。二、抗人荧光素标记抗体(FITC荧光素标记)的制备1.荧光素标记用抗人抗体IgG(或IgM μ链)经检定合格后用于荧光素标记。抗人抗体的纯度用SDS-PAGE测定，在上样量为10μg条件下应为一条带。
2.来源FITC(异硫氰酸荧光素)构自Sigma公司。
3.标记方法采用直接法进行荧光素标记。
3.1步骤3.1.1以0.01mol/l pH7.1PBS调整蛋白浓度到20mg/ml，放于称量瓶中；3.1.2取相当于蛋白量1/100的FITC，溶解于相当蛋白溶液1/10体积的0.5mol/l，pH9.5碳酸盐缓冲液；3.1.3在搅拌条件下将FITC缓慢的加入IgG(或IgMμ链)蛋白液内，室温20℃左右。磁力搅拌标记4h；3.1.4将标记溶液对10～50倍PBS充分透析2～4h。
4.FITC标记抗体的纯化4.1步骤4.1.1 Sephadex G-50凝胶过滤去除游离FITC；4.1.1.1层析柱2×30cm玻璃层析柱，柱内底部垫尼龙网；4.1.1.2洗脱液0.01mol/l pH 7.1 PBS；4.1.1.3流速0.1～1ml/min；4.1.1.4加样量凝胶柱床体积的10～15％；4.1.1.5当样品加入到柱中后将在柱中被分为三个区带，柱上部荧光区带为结合FITC较强的蛋白及游离FITC；中部为无色的洗脱液；柱下部为FITC标记的抗体，收集这部分即是荧光素标记抗体。
4.1.2 DEAE-纤维素柱层析纯化标记IgG(或IgMμ链)4.1.2.1层析柱要求同上，内装充分容涨及平衡的纤维素(根据需要装柱床体积)。
4.1.2.2洗脱液0.01mol/l pH 7.1 PBS；4.1.2.3流速1ml/min；4.1.2.4加样量根据纤维素的蛋白吸附容量计算。
4.1.2.5洗脱时，将柱中第一个色带(标记抗体)洗脱完毕为止。
4.2保存-20℃。
5.荧光素标记抗体的外观检定黄绿色、澄清、无混浊、无沉淀。
6.FITC标抗体的浓度选择FITC标抗体分别在1∶20～1∶640的范围进行滴定，根据滴定结果确定FITC标记抗体的浓度，选择荧光亮度及形态均好的浓度作为使用浓度。三、荧光抗体稀释液的制备准确称取0.2g伊文思兰，加入蒸馏水配制成为0.2％储存液。使用时稀释至0.02％，室温保存备用。四、标本血清稀释液的制备0.005mol/l PBS pH 7.2(配方为NaCl 29.2g，NaH2PO4·2H2O 3.9g，Na2HPO47.1g，加蒸馏水至5000ml)五、阳性对照血清的制备选用经56℃ 30min灭活处理后的10份SARS病人抗体阳性血清混合，按适当的比例稀释阳性血清混匀后，-20℃冻存备用。六、阴性对照血清的制备选用经56℃ 30min灭活处理后的10份SARS病毒抗体阴性血清混匀后，按适当的比例稀释阴性血清，-20℃冻存备用。七、反应时间的确定选用三份SARS病人抗体阳性血清和一份阴性血清，分别在不同的反应时间进行反应。当检测待检样品IgG时，37℃孵育30min，病人血清中IgG抗体与病毒抗原达最大结合状态，故确定30min为最佳反应时间。当检测待检样品IgM时，病人血清中IgM抗体与病毒抗原37℃孵育2h达最大结合状态，故确定2h为最佳反应时间。八、阴性参考品符合率10份阴性参考品不得出现假阳性。九、阳性参考品符合率
10份阳性参考品不得出现假阴性。十、无菌试验液体组分在加入防腐剂前，抽样进行无菌试验。十一、稳定性试验试剂各组在-20℃放置24个月。十二、分装各组分检定合格后进行分装，贴签。十三、组装按试剂盒组成成分组装。
实施例三 SARS病毒抗体免疫荧光检测试剂盒使用说明书本发明的SARS病毒抗体免疫荧光检测试剂盒其使用说明书包括以下内容一、用途与原理用于病人血清中SARS病毒特异IgG(或IgM)抗体检测，为非典型肺炎的临床诊断提供参考。
本试剂盒利用免疫荧光抗体技术，通过荧光显微镜进行结果判断。
二、试剂盒内容SARS病毒感染细胞抗原片5张SARS病毒抗体阳性对照 100μl正常人血清阴性对照100μl抗人IgG(或IgMμ链)荧光素标记抗体 30μl(40μl)荧光抗体稀释液1000μl标本血清稀释液2000μl试剂盒使用说明书 1份
SARS病毒感染细胞抗原片示意图见附
图1。
三、操作步骤1.首先将待检病人血清标本用血清标本稀释液进行1∶10稀释，然后，56℃ 30min灭活。
2.将SARS病毒抗原片取出，室温放置5min，使抗原片温度与室温平衡。
3.将灭活后的待检病人血清再倍比稀释，使之成为1∶20。每份标本血清取1∶10和1∶20两个稀释度，每个稀释度取10μl，分别滴加在抗原片的不同孔上(如图1所示)。
4.置玻片于湿盒中37℃作用30min(检测IgM时作用2h)。将玻片取出，自来水冲洗，晾干。
5.用荧光抗体稀释液将标记的抗人IgG荧光抗体进行1∶40(检测IgM时作用1∶20)稀释，然后滴加到抗原片上，每孔10μl。
6.置玻片于湿盒中37℃作用30min。冲洗同前，晾干。
7.荧光显微镜下观察染色结果。根据胞浆或胞膜部位有无特异荧光染色来判断结果，如图2所示。
8.检测要同时设阳性血清和阴性血清对照。
9.结果判断胞浆或胞膜部位有特异荧光染色为阳性，无特异荧光为阴性。阳性可依据荧光亮度和阳性细胞的多少综合判定分别记为“+～++++”，阴性记为“-”。
四、注意事项1.要自备2-20μl和20-200μl移液器各一支。
2.荧光抗体要根据每次需要量现稀释。
3.染色操作中，在往抗原片上滴加标本血清和标记抗体时，注意不要划掉玻片上的细胞。
4.染色过程中，滴加样品时应防止液体外溢和干燥，冲洗要彻底。
5.荧光显微镜下观察时要仔细，防止漏掉弱阳性，同时要注意区别非特异荧光颗粒与特异荧光染色。
五、规格20人份六、储藏-20℃保存七、有效期2年八、制造单位军事医学科学院微生物流行病研究所实施例四 SARS病毒抗体免疫荧光检测试剂盒临床使用效果将各医院临床诊断为非典型肺炎病人的血清标本采用本发明的试剂盒进行IgG/IgM检测，结果如下表。
间接免疫荧光法(IFA)对临床诊断非典病人血清抗体(IgG/IgM))检测结果临床诊断IFA合计非典病人 其它病人阳性 991 100阴性 1468 82合计 113 69 182从表中数据可以得出灵敏度＝(99/113)×100％＝87.6％特异性＝(68/69)×100％＝98.6％符合率＝[(99+68)/182]×100％＝91.8％阳性预测值＝[99/(99+1)]×100％＝99.0％阴性预测值＝[68/(14+68)]×100％＝82.9％可以看出，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性，符合率较高。
权利要求
1.一种检测SARS病毒抗体的试剂盒，包括以下部分SARS病毒感染细胞抗原片SARS病毒抗体阳性对照血清正常人血清阴性对照抗人荧光素标记抗体荧光抗体稀释液标本血清稀释液
2.制备权利要求1所述的试剂盒的方法包括以下步骤SARS病毒感染细胞抗原片的制备；SARS病毒抗体阳性对照血清的制备；正常人血清阴性对照的制备；抗人荧光素标记抗体的制备。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的所述的SARS病毒为严重急性呼吸系统综合征(SARS)的病原体，为一种或多种新的冠状病毒。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的所述的抗人荧光素标记抗体为抗人IgG抗体或抗人IgMμ链抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述的SARS病毒抗体为抗SARS病毒IgG抗体或IgM抗体。
6.根据权利要求2所述的方法，其中SARS病毒感染细胞抗原片的制备包括以下步骤(1)制备SARS病毒感染细胞悬液；(2)将细胞悬液滴加在镀膜玻片上培养；(3)洗去悬浮细胞，晾干；(4)固定、晾干、密封后-20℃冻存。
7.根据权利要求2所述的方法，其中SARS病毒抗体阳性对照血清的制备包括以下步骤选用经灭活处理后的SARS病毒IgG或IgM抗体阳性血清，按适当的比例稀释混匀。
8.根据权利要求2所述的方法，其中正常人血清阴性对照的制备包括以下步骤选用经灭活处理后的SARS病毒抗体阴性血清，按适当的比例稀释。
9.根据权利要求2所述的方法，其中抗人荧光素标记抗体的制备包括以下步骤(1)抗人荧光素标记抗体的制备；(2)抗人荧光素标记抗体的纯化。
10.根据权利要求1所述的试剂盒在检测人血清标本中SARS病毒抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测SARS病毒抗体的试剂盒，其制备方法及用途。本发明将感染SARS病毒的细胞固定在玻片上制成抗原片，采用间接免疫荧光法原理检测人血清标本中SARS病毒抗体，为非典型肺炎的临床诊断提供参考。本发明的试剂盒具有使用简便，快捷，灵敏度和特异性高，稳定性好的优点，有着广阔的市场前景。
文档编号G01N33/533GK1445549SQ03124299
公开日2003年10月1日 申请日期2003年5月9日 优先权日2003年5月9日
发明者祝庆余, 秦鄂德, 杨保安, 司炳银, 于曼, 刘洪 , 吕富双 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所