专利名称：应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条的制作方法
技术领域：
本发明属生物化学、酶工程和医学临床诊断技术领域，涉及的是一种将室温玻化技术应用于生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条。
背景技术：
乙醇检测的用途广泛，它包括医院对乙醇中毒患者的检测、企业对诸如矿井、有机溶剂生产车间或仓库等易燃、易爆场所作业人员有否酒后操作的监测等。在日本，著名的超市、宾馆等行业，订立有不定时检测在职员工有否酒后上岗影响服务质量的制度。在欧美国家，正在形成私车家庭成员饮酒后选择何人唾液乙醇浓度最低就由何人驾车的自测工具(参见美国专利No.5563073，Titmas，TPersonal blood alcohol lavel testing kit，October 8，1996)。尽管如此，乙醇检测最为重要的用途是用于机动车驾驶员体内酒精浓度的测定。
酒后驾车是一个世界性的安全问题。据国外报道，每年约有25％～30％的交通死亡事故与酒后驾车有关。据世界卫生组织(WHO)公布，全球每年有300多万人因车祸丧生，其中80％以上的交通事故是由司机引发，而其中50％以上则属司机酒后驾车所致。在我国，近10年来，交通事故死亡人数约以每年10％的速度递增，平均每年死亡约5万人，其中有3％是由酒后驾车引发。为此，国际上许多国家立法规定了血液或唾液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，并建立了能准确定量检测乙醇的方法与装置。
关于乙醇检测，经典的是采用“顶空”气相色谱法。此法具有高的灵敏度和特异性，但只能在实验室由专职人员操作，无法满足现场分析的需要。目前，我国采用国外进口的呼气式乙醇测定仪进行现场分析，不但其价格昂贵，特异性差，测定精度只有76％(参见上述美国专利No.5563073)，而且因呼气人虚假般的呼气方式，常需测试多次，延误交通事故处理的时间。这种不良的现场操作性能，也导致国内一些大城市化巨资购置的此种设备闲置或少用。上世纪，国外医学界有关血乙醇和唾液乙醇具极好相关性的大量研究结果(详见综述HofmanLF.Human saliva as a diagnostic specimen.J Nutr 2001 May；131(5)1621S-5S)，导致了测定唾液乙醇含量的商品问世。如采用乙醇脱氢酶和过氧化物酶反应系统的薄层层析棒，商品名STC Diagnostics Q.E.D.A150(orA350)Saliva Alcohol Test(Manufactured by STC Technologies，Inc.)，世人对其评价颇高(详见Smolle KH，Hofmann G，Kaufmann P，Lueger A，Brunner G.Q.E.D.Alcohol testa simple andquick method to detect ethanol in saliva of patients in emergency departments.Comparison with the conventional determination in blood.Intensive Care Med 1999May；25(5)492-5)；但是可惜，此产品仍属目测法、半定量性质。
关于传感器，自从1975年Divies，C.研制成功第一支电流型微生物传感器以来，各种生物传感器(biosensors；简称BS)如雨后春笋般地蓬勃发展起来。从其转换器件而言，已由电流型、电位型、场效管型，发展到现代的表面等离子共振(surface plasma resonance)。从其识别器件而言，已由固定化微生物电极、酶电极、免疫分子电极，发展到现代的由DNA芯片组成的核酸探针。从其所用电极形式而言，也由柱式、膜式、针式、片式，发展到现代的一次性试条式。其用途，也由原来只用于发酵工业与生化制品生产流程中的质控等，拓展到医药卫生、环境监测、食品检验、基因分析等领域。
迄今为止，市场上已有两类适于家庭自测的一次性试条式生物传感器商品。二者的差别在于信号转换器件一种系根据电化学原理设计的电化学传感器；另一种系根据光谱原理设计的反射光式传感器。可惜的是，这两类商品皆只限于测定血糖，这是因为其所用试条依赖的葡萄糖氧化酶比较稳定之故，其它氧化酶，尤其是乙醇氧化酶，则极不稳定，难以制成商品化的传感器。
关于采用乙醇氧化酶和过氧化物酶双酶系统的乙醇测试条，以及与其配套的反射光式乙醇定量传感器，迄今为止尚未见有商品问世。究其原因，主要在于乙醇氧化酶极易自氧化且高度不稳定性所致。
有关乙醇氧化酶反应系统已有众多论著和专利，它们提出了种种配方，但至今仍无商品问世。究其原因，在于乙醇氧化酶(AOD)和其显色试剂的高度不稳定性。就乙醇氧化酶试剂而言，其在最适pH值、室温为25℃下只可存放一天，在4℃冰箱内只可存放3天。从生物化学理论看，乙醇氧化酶的分子量大于30万道尔顿，来自不同微生物的乙醇氧化酶差别极大。而作为底物的乙醇，分子量极小，仅为46.07道尔顿。二者分子量的巨大差异导致较高浓度乙醇时会出现不呈线性的假阳性值。此外，乙醇氧化酶分子活性中心结构中含有半胱氨酸和丝氨酸，前者所含巯基和后者所含羟基皆可自氧化而使酶失活。关于显色剂，可采用的品种虽说有许多，但皆具有“见光变色”的通病，极不稳定。
发明内容
鉴于上述原因，本发明的任务是提供一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，它解决了上述呼气式乙醇测定仪价格昂贵、特异性差和传感器商品仅限为测定血糖以及乙醇氧化酶反应系统配方不佳的问题。
本发明的技术方案如下一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，所述双酶试条的配方为缓冲系统用量0.5～0.8M，pH值6.5～8.0，表面活性剂是丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)，用量0.1％～0.3％(v/v)，乙醇氧化酶(AOD)活化剂是叠氮化钠(NaN3)，用量0.05％～0.10％(w/v)，还原剂用量0.01％～0.10％(w/v)，稳定剂是VI型玻化载体，由山梨醇、明胶、右旋糖苷和植物种子粗提液组成，用量5％～15％(w/v)，显色剂用量1.0％～2.5％(w/v)，显色剂溶剂是二甲苯原液，助染剂是褚红染料，用量0.5％～1.5％(w/v)，乙醇氧化酶源自酵母菌(Candida sp.)，用量30～45u/ml，过氧化物酶采用辣根过氧化物酶(HRP)，用量450～650u/ml。
本发明应用自创室温玻化技术(中国发明专利公开号CN1216677A)，使乙醇氧化酶在室温下稳定，并将该玻化技术首次应用于生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，生产的产品为便携式一次性玻态试条式传感器，能定量检测唾液乙醇，利于现场分析。
本发明采用自制玻化载体作为乙醇氧化酶和过氧化物酶的稳定剂，由此制成的双酶试条，经37℃破坏一月，酶活力丝毫无损。按本方法检测唾液乙醇浓度在0.01％～0.15％范围内，完全符合司法监测要求。另外，本发明采用助染法，使阴性(红色)和阳性(蓝色)色差分明，且因玻化载体的存在，使阳性所显蓝色能在室温下长期不变色，从而有利于司法物证的保存。本试条配以专用反射光式检测器，组成了可以定量检测的轻便的手持型传感器，唾液试样只需5～10μL，在一分钟内即可得知结果。
具体实施例方式
本发明是一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其配方如下缓冲系统用量0.5～0.8M，pH值6.5～8.0；表面活性剂是丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)，用量0.1％～0.3％(v/v)；乙醇氧化酶(AOD)活化剂是叠氮化钠(NaN3)，用量0.05％～0.10％(w/v)；还原剂用量0.01％～0.10％(w/v)；稳定剂是VI型玻化载体，用量5％～15％(w/v)；显色剂用量1.0％～2.5％(w/v)；显色剂溶剂是二甲苯原液；助染剂是褚红染料，用量0.5％～1.5％(w/v)；乙醇氧化酶源自酵母菌(Candidasp.)，用量30～45u/ml；过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP)，用量450～650u/ml。
其中缓冲系统组合物最佳采用三羟甲基氨基甲烷(Tris)与丙二酸，也可用磷酸类化合物或柠檬酸类化合物替代。
表面活性剂可用Triton X-100、Emulphor ON 870等替代。
还原剂化合物可以是还原型谷胱甘肽(GSH)，也可用巯基乙醇替代。
稳定剂VI型玻化载体是由山梨醇、明胶、右旋糖苷T10和植物种子粗提液组成。
显色剂化合物最佳为四甲基联苯胺(TMB)，因为它不会致癌。显色剂化合物也可以是邻苯二胺，或者是4-氨基安替比林，它们可以任意替换。
助染剂可以用各种颜色的染料替代。
本发明采用乙醇氧化酶(AOD)反应系统。其反应机制为
式中TMB为N，N，N′，N′-四甲基联苯胺。本发明采用下列制备工艺
第一步，取一卷0.5cm宽的新华厚型定量层析滤纸，通过由显色剂、显色剂溶剂与助染剂组成的试剂槽后，在50℃热风、避光下干燥10min，保存于具蓝色硅胶干燥剂的蓝色干燥箱中备用。该滤纸条呈助染剂红色，可保存至少三个月不变色。
以下均在设置于10万级净化室内的局部去湿柜中操作，柜内相对湿度控制在30％。
第二步，取按第一步制备好的已染滤条所需长度，通过由缓冲系统、表面活性剂、乙醇氧化酶(AOD)活化剂、还原剂、稳定剂、乙醇氧化酶与过氧化物酶组成的试剂槽后，在30℃热风、避光下干燥10min，移入设置于10万级净化室内的室温玻化机中玻化，玻化机各参数设置为底板温度40℃，气室温度30℃，相对湿度30％，玻化时间40min，此即为外观呈红色的试剂垫。
第三步，将按第二步制备好的试剂垫，裁成20cm长，粘贴在长20cm、宽4cm的单面含胶的白色聚酯板之最前端，再取长20cm、宽6cm的单面含胶有色纸，把一片长20cm、宽0.5cm、厚1.5mm的强吸水纸，和另片长20cm、宽0.5cm的常规滤纸，分别粘贴在此纸最前端和离最前端1.5cm处，把此聚酯板和有色纸面对面地粘贴在一起，须使强吸水纸覆盖在试剂垫上，再把有色纸两端长出部分反卷粘贴于聚酯板背面，即为试条成品。
第四步，将批量生产粘贴好的试条板，用具有自控程序的切纸机切成宽0.5cm的试条，包装入以单片分隔、且各含一粒蓝色硅胶的5片为一组的铝箔袋中，热压封口，贴上标签即为乙醇测试条产品。
最后，把主机、试条、与试条数相等的一次性吸液管、使用说明书，组装入皮套即为定量检测唾液乙醇试剂盒成品。
本发明的双酶试条在测试时，撕开一片含试条的铝箔袋，取出试条，从试条背面手持部，沿试条向前面撕开一部分，使试剂垫的红色部分露出。用一次性吸液管吸取饮过酒者之唾液，点少量(约5～10微升)于试剂垫上，启动主机使其倒计时60秒钟，与此同时试剂垫逐渐变蓝。当剩余至20秒钟时，主机会发出“哔哔”声，此时将面纸上的强吸水纸按下，使其吸去试剂垫上多余唾液后，再把试条插入主机。当到达60秒钟时，主机即显示乙醇含量，记下读数即告测试完成。
同理，本双酶试条在测试时可省略反射光式检测器步骤，转化成半定量的目测。在试剂盒中用具有乙醇各浓度标示量的标准色卡替换反射光式检测器，测试步骤基本同上，加唾液试样后改用手表计时，1分钟时所显蓝色强度，用标准色卡与其比较，记下色卡上同等色强的乙醇标示量即告测试完成。
权利要求
1.一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述双酶试条的配方为缓冲系统用量0.5～0.8M，pH值6.5～8.0，表面活性剂是丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)，用量0.1％～0.3％(v/v)，乙醇氧化酶(AOD)活化剂是叠氮化钠(NaN3)，用量0.05％～0.10％(w/v)，还原剂用量0.01％～0.10％(w/v)，稳定剂是VI型玻化载体，由山梨醇、明胶、右旋糖苷和植物种子粗提液组成，用量5％～15％(w/v)，显色剂用量1.0％～2.5％(w/v)，显色剂溶剂是二甲苯原液，助染剂是褚红染料，用量0.5％～1.5％(w/v)，乙醇氧化酶源自酵母菌(Candida sp.)，用量30～45u/ml，过氧化物酶采用辣根过氧化物酶(HRP)，用量450～650u/ml。
2.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述缓冲系统组合物是三羟甲基氨基甲烷(Tris)与丙二酸。
3.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述缓冲系统组合物是磷酸类化合物或柠檬酸类化合物。
4.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述还原剂化合物是还原型谷胱甘肽(GSH)。
5.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述还原剂化合物是巯基乙醇。
6.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述显色剂化合物是四甲基联苯胺(TMB)。
7.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述显色剂化合物是邻苯二胺。
8.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，所述显色剂化合物是4-氨基安替比林。
9.根据权利要求1所述的应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其特征在于，采用下列制备工艺第一步，取一卷0.5cm宽的新华厚型定量层析滤纸，通过由显色剂、显色剂溶剂与助染剂组成的试剂槽后，在50℃热风、避光下干燥10min，保存于具蓝色硅胶干燥剂的蓝色干燥箱中备用；第二步，取按第一步制备好的已染滤条所需长度，通过由缓冲系统、表面活性剂、乙醇氧化酶(AOD)活化剂、还原剂、稳定剂、乙醇氧化酶与过氧化物酶组成的试剂槽后，在30℃热风、避光下干燥10min，移入设置于10万级净化室内的室温玻化机中玻化，玻化机各参数设置为底板温度40℃，气室温度30℃，相对湿度30％，玻化时间40min，此即为外观呈红色的试剂垫；第三步，将按第二步制备好的试剂垫，裁成20cm长，粘贴在长20cm、宽4cm的单面含胶的白色聚酯板之最前端，再取长20cm、宽6cm的单面含胶有色纸，把一片长20cm、宽0.5cm、厚1.5mm的强吸水纸，和另片长20cm、宽0.5cm的常规滤纸，分别粘贴在此纸最前端和离最前端1.5cm处，把此聚酯板和有色纸面对面地粘贴在一起，须使强吸水纸覆盖在试剂垫上，再把有色纸两端长出部分反卷粘贴于聚酯板背面，即为试条成品；第四步，将批量生产粘贴好的试条板，用具有自控程序的切纸机切成宽0.5cm的试条，包装入以单片分隔、且各含一粒蓝色硅胶的5片为一组的铝箔袋中，热压封口，贴上标签即为乙醇测试条产品。
全文摘要
本发明涉及一种应用玻化技术生产定量检测唾液乙醇传感器用双酶试条，其配方为缓冲系统用量0.5～0.8M，pH值6.5～8.0；表面活性剂是丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)，用量0.1％～0.3％(v/v)；乙醇氧化酶(AOD)活化剂是叠氮化钠(NaN
文档编号G01N33/98GK1553185SQ03128880
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月28日 优先权日2003年5月28日
发明者范培昌, 张蔚, 吴何坚 申请人:上海保康生物高科技有限公司