专利名称：具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器的制作方法
技术领域：
本发明属于光学检测仪器范围，特别涉及适用于化学分析、环境监测、免疫分析、DNA检测、药物筛选等领域中检测分子或监测分子中结构变化的一种具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器。
背景技术：
表面等离子共振(SPR)是一种物理光学现象。当平行于表面的偏振光以一定的入射角(表面等离子角)照在金属和配体分子膜间的界面上，在界面上发生全反射时，入射光被耦合进入金属和配体分子膜间的界面，形成沿界面传播的电磁波，即表面等离子体(SP)。以表面等离子角入射的光线由于表面等离子体谐振将引起界面反射率显著降低，由于SPR对附着在金属表面的配体分子膜的折射率非常敏感而可被检测，不同配体分子膜的表面等离子角不同；而同一种材料，附着在金属表面的量不同，则SPR的响应强度不同。根据上述原理，SPR分子传感器通常将已知的分子(如配体分子)固定在几十纳米厚的金属(金、银等)膜表面，加入与其互补的目标分子，两者结合将使金属膜与溶液界面的折射率上升，从而导致谐振角改变，如果固定入射角度，就能根据谐振角的改变程度对互补的目标分子进行定量检测。整个传感过程包括(1)分子的相互作用(偶联)；(2)敏感层配体分子膜变化(介电常数/折射率改变)；(3)传感器电磁场变化(反射光波衰减)；(4)光电信号检测；(5)信号的连续检测与分析。
SPR传感器主要包括光波导耦合器件、金属膜、配体分子膜三个组成部分。
1.光波导耦合器件将光波与SP耦合并使其发生共振，必须使用耦合器件。常用的耦合器件主要为棱镜。可选择的棱镜几何形状为直角等腰三角形或半球形。半球形可保证任何角度的入射光均与界面垂直，反射光损失小，而且进入棱镜后的角度不变。对于SPR研究，棱镜与介质的折射率差别越大，测量灵敏度越高。为了提高灵敏度，应选择折射率较高的光学材料制作棱镜，如BK7(折射率1.51650)，SF12(折射率1.64831)，SF6(折射率1.80518)。
2.光源(1)固定波长改变入射角测量方式的SPR装置多采用He-Ne激光器(波长632.8nm)作为光源。用激光器作为光源，单色性好，强度高。另外发光二极管(LED)也可作为SPR光源，波长多为近红外(波长760nm)。LED的单色性较好，而且体积小，价格低，使用寿命长。(2)固定入射角改变波长测量方式的SPR装置，光源是能发射各种波长的连续光源，并且具有足够的强度和稳定性。
3.金属膜Au膜和Ag膜是在SPR中最常用的两种金属薄膜。Ag膜具有很高的反射率和较高的测量灵敏度，稳定性高于Al膜，是SPR的首选金属膜。Au膜的稳定性最好，具有较强的化学惰性，尤其适用Ag膜不能使用的体系。从SPR光谱的三个特征参数(共振波长或共振角共振宽度和共振深度)来看，在同样的条件下，Ag膜的共振波长或共振角的变化明显比Au膜灵敏，共振深度约大于Au膜，共振半峰宽明显小于Au。金属薄膜的厚度直接影响共振深度，随着金属膜的厚度的增加，共振深度变小，即最小反射系数变大。
金属膜的制作方法通常是真空蒸镀、磁控溅射等，膜厚度通常是50～90nm。
4.配体分子膜本研究中的配体分子膜的成膜方法有金属膜直接吸附法、共价连接法、LB成膜法以及分子印膜技术。直接吸附法原理与操作都很简单，而且方法本身就可以作为可吸附分子的检测技术。作为检测配体分子的方法时，有的分子无法在金属表面上形成稳定的膜，有时分子虽然很容易吸附在金属表面上，但是由于活性区域空间障碍和取向效应，或大分子团聚而使亲和反应不易发生，使应用受到许多限制。共价连接法通常是在金膜的表面先覆盖一层生物素或葡聚糖凝胶，使检测器表面具有均一性，而在功能上具有了特异性，消除了分子非特异性亲和的问题。葡糖凝胶传感器表面膜厚度约为100～150nm。(3)LB成膜法也称为单分子复合膜技术，可把液面上有序排列的某些有机化合物逐层转移到固定基片上，实现基片上的特定分子的高度有序排列。膜厚度控制可以精确到数十埃。(4)分子印膜技术是在分子水平上构造敏感表面，并结合表面单分子自组织层技术(SAM)，提高SPR的敏感表面的稳定性和灵敏度。
5.响应曲线分析方法根据SPR的激励原理，分析入射角—反射光强度响应曲线有4种方法(1)角度调制法固定入射光的波长，改变入射角度，观察反射光的归一化强度。(2)波长调制法固定入射光的角度，改变入射光的波长，观察反射光的归一化强度。(3)强度调制法固定入射光的角度和入射光的波长，凭借强度的变化测量折射率的变化。(4)相位调制法固定入射光的角度和入射光的波长，观测入射光和反射光的相差。
表面等离子体振子共振检测器是分子生物学与光学、电化学、微电子学等相结合的产物，具有非破坏性、高灵敏度和实时在线检测等优点，可以在原位实时监测分子间的相互作用而无需任何标记，因而可用于多种成份的分子间相互作用的研究，包括化学，生物化学，生物技术、分子生物学和微生物学检测，如环境监测、血液分析、抗原抗体分析、有毒气体检测、免疫分析、蛋白质分子相互作用研究、DNA的复制和转录分析、药物筛选、连续监测吸附和解吸及分子的缔合和解离的动力学过程研究等许多领域中具有广泛的应用前景。它可与聚合酶连锁反应(PCR)等技术一同使用，用于识别基因序列，并可以用于分析气体、液体样品。
优化SPR生物检测器结构，提高SPR的灵敏度，实现检测自动化和测量装置的微型化、低价格化等将是目前研究开发工作的重点。
发明内容
本发明的目的是提出一种具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于采用小弧度的柱面镜1作为折射器件、在柱面镜1上方的平面上制作金属薄膜4作为敏感膜，它可与柱面镜1集成在一起或淀积在可分离的基体上，敏感膜上方为反应池，柱面镜1的下方为阵列光电检测器5，左边为入射光源2，光源2、光电检测器5、步进电机6与控制器7连接，控制步进电机6带动光源2、阵列光电检测器5来回移动；以检测出不同波长、不同位置入射光的光强度的变化，控制器7与计算机8接口连接。柱面镜1的长高比在5倍～10倍之间，光线在器件内发生2～3次全反射。为方便检测，在柱面镜1的出射端加镀金属反射层3，使出射光反射到入射光的同一面。
所述光源可选用白光、红光、绿光或蓝光二极管阵列，以适应不同被测物质的特征吸收波长。控制发射光的光束大小，可以在阵列光电检测器5前不加聚光镜，直接测量出射光束的光斑大小与能量。
所述金属薄膜4为Au或Ag。
本发明的有益效果是与传统的单点全反射相比，1.光源发出的光通过柱镜照射到柱镜和金属薄膜之间，发生多次内部全反射，并被该膜上固定的检测样本分子吸收，可以使折射光路和出射的光强度同时发生变化，从而提高了表面等离子体振子共振检测的灵敏度和信号分辨率。
2.出射光线采用阵列光电检测器5进行检测，以区分发生表面等离子体振子共振的角度。
3.光源与检测器的位置调整采用自动控制，整个装置结构紧凑，不受背景光的影响。
图1为多次全反射表面等离子共振检测器的结构示意图。
图2为柱镜的上视图及多通道样品池示意图。
图3为加宽光束后的光路图。
具体实施例方式
本发明为一种具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器。其结构如图1所示，采用小弧度的柱面镜1作为折射器件、在柱面镜1上方的平面上制作Au或Ag金属薄膜4作为敏感膜，对于不同被测物质的特征吸收波长可以分道制作金属薄膜4(如图2所示)，它可与柱面镜1集成一起或淀积在可分离基体上，敏感膜上方为反应池。两端再制作金属反射层3，如厚的铝或银等。柱面镜1的长高比在5倍～10倍之间，光线在柱面镜1内发生2～3次全反射。使柱面镜1的下方为阵列光电检测器5，左边为入射光源2，光源2、光电检测器5、步进电机6与控制器7连接；采用步进电机6驱动光源2移动，从而调整入射光的角度，以不同位置入射(如图3所示)。并选用白光、红光、绿光或蓝光二极管阵列，以适应不同被测物质的特征吸收波长。控制发射光的光束大小，可以在阵列光电检测器5前不加聚光镜，直接测量出射光束的光斑大小与能量，采用步进电机6驱动阵列光电检测器5移动，从而跟随出射光的角度调整阵列光电检测器5的位置。
光源控制、步进电机控制和阵列光电检测器检测信号经过微控制器处理后通过USB接口与计算机相连接，并通过计算机软件控制光源(即选择不同的发光波长的光源)、入射光角度、阵列光电检测器的接收角度，实现自动检测，以检测出不同波长、不同位置的光强度的变化。折光器件的长高比在5倍～10倍之间，光线在器件内发生2～3次全反射。为方便检测，在折射器件的出射端加镀金属反射层3，使出射光反射到入射光的同一面。
本发明可以在原位实时监测分子间的相互作用而无需任何标记，因而可用于多分子相互作用的研究，包括化学，生物化学，生物技术、分子生物学和微生物学检测，如在环境监测、血液分析、抗原抗体分析、有毒气体检测、免疫分析、蛋白质分子相互作用研究，DNA的复制和转录分析、药物筛选、连续监测吸附和解吸及分子的缔合和解离的动力学过程研究等许多领域中具有广泛的应用前景。它可与聚合酶连锁反应(PCR)等技术一同使用，用于识别基因序列，并可以用于分析气体、液体样品。
权利要求
1.一种具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于在小弧度的柱面镜(1)上方的平面上制作金属薄膜(4)，左边为入射光源(2),两端加镀金属反射层(3)，使出射光反射到入射光的同一面；右端下方为阵列光电检测器(5)，光源(2)、光电检测器(5)、步进电机(6)与控制器(7)连接，控制步进电机(6)带动光源(2)、阵列光电检测器(5)来回移动；以检测出不同波长、不同位置入射光的光强度的变化，控制器(7)与计算机(8)的接口连接。
2.根据权利要求1所述具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于所述柱面镜的长高比在5倍～10倍之间，以达到光线在器件内发生2～3次全反射。
3.根据权利要求1所述具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于所述光源可选用白光、红光、绿光或蓝光二极管阵列，以适应不同被测物质的特征吸收波长。
4.根据权利要求1所述具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于所述金属薄膜4为Au膜或Ag膜。
5.根据权利要求1所述具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器，其特征在于所述出射端加镀金属反射层(3)为厚Al膜或厚Ag膜。
全文摘要
本发明公开了属于光学检测仪器范围的一种具有多次全反射的高灵敏度的表面等离子共振检测器。在柱面镜上方的平面上制作金属薄膜作为敏感膜，柱面镜的下方为光电检测器，左边为入射光源。与传统的单点全反射相比，光源发出的光通过柱镜照射到柱镜和金属薄膜之间，发生多次内部全反射，可以使折射光路和出射的光强度同时发生变化，并被该膜上固定的检测样本分子吸收，从而提高了表面等离子体振子共振检测的灵敏度和信号分辨率。本发明可以在原位实时监测分子间的相互作用而无需任何标记，因而可用于多分子相互作用的研究，包括化学，生物化学，生物技术、分子生物学和微生物学检测。
文档编号G01N21/21GK1529147SQ200310100368
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月14日 优先权日2003年10月14日
发明者鲍军波, 王菊英, 刘理天, 任天令 申请人:清华大学, 国家海洋环境监测中心