专利名称：蛋白类蛋白酶体激活剂亚基3(pse3)作为结直肠癌标记物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结直肠癌的诊断。本发明公开了蛋白类蛋白酶体激活剂亚基3(＝PSE3)在结直肠癌诊断中的用途。而且，本发明特别涉及通过检测个体来源的液体样品中的PSE3而由所述样品诊断结直肠癌的方法。PSE3的检测例如可用于结直肠癌的早期检测或诊断。
癌症仍然是一种主要的公共健康挑战，尽管检测和治疗有所进展。在各种类型的癌症中，结直肠癌(＝CRC)是在西方世界中最常发生的癌症之一。
癌症被检测/诊断得越早，整体存活率就越好。这对CRC来说尤为正确。晚期肿瘤的预后很差。超过1/3的患者在确诊后5年内死于进行性疾病，相当于5年内的存活率约为40％。目前的治疗仅治愈了一小部分患者，并且明显地对那些在疾病早期获得诊断的患者的作用最好。
鉴于CRC是一种公共健康问题，必须开发出更有效地筛选和预防性检测结直肠癌的方法。
目前可用的最早期结直肠癌检测方法包括使用便血检查或内窥镜方法。但是，在检查便血前，一般必须存在明显的肿瘤大小。基于愈疮木脂的大便潜血检查的敏感性约为26％，这意味着74％的具有恶性肿瘤病灶的患者仍然不能被检测出来(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。目测癌症前期和癌症病灶是最好的早期检测方法，但结肠镜检查是侵入性的，成本高、风险大且有并发症(Silvis，S.E，et al.，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，et al.，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.，et al，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
在近些年，已经报道了海量的所谓结肠特异性基因乃至所谓的结直肠癌特异性基因。大多数的相应研究论文或专利申请都是基于通过分别分析结肠(癌)组织和不同组织或邻近正常组织的RNA表达谱所获得的数据。这样的方法可概括为差异mRNA展示技术。
作为可由mRNA展示技术获得数据的实例，应提及和讨论WO01/96390。该申请描述并要求保护200种以上的分离的多核苷酸以及同样多的对应的多肽，以及其检测CRC的用途。但是，通过对应蛋白的水平不能监测mRNA水平的差异是常识。稀有mRNA编码的蛋白的存在量可能非常大，而高丰度mRNA编码的蛋白可能仍然难以检测到或根本无法发现。mRNA水平和蛋白水平之间缺乏关联是源于以下的原因，如mRNA稳定性、翻译效率、蛋白稳定性等。
还有一些新方法研究不同组织之间或健康组织和患病组织之间的蛋白谱差异，以鉴别可用于诊断CRC的侯选标记分子。Brünagel，G.，et al.，Cancer Research 62(2002)2437-2442鉴别了7种核基质蛋白，这些蛋白在CRC组织中的丰度似乎高于邻近的正常组织。没有报道得自个体的液体样品的数据。
WO 02/078636报告了约9种由表面增强激光吸收和离子化(SELDI)发现的结直肠癌相关蛋白质点。与得自健康对照的血清相比，在得自CRC患者的血清中更常观察到这些蛋白质点。但是，不知道这种点中包含的分子的身份(例如其序列)。
尽管CRC领域中列出的侯选蛋白标记庞大且不断增长，但迄今为止这些分子的临床/诊断效用还未知。为了在临床上有效用，作为单个标记物的新诊断标记物至少应当和本领域已知的最好单个标记物一样好。或者，新标记物分别在单独使用或和一种或多种其它标记物联用的情况下，应当使诊断的敏感性和/或特异性有进步。检查的诊断敏感性和/或特异性最好通过下文详述的其受试者操作特征曲线来评价。
目前，在CRC领域仅有基于癌胚抗原(CEA，一种肿瘤相关糖蛋白)的诊断性血检可用于帮助诊断。在95％的得自结直肠癌、胃癌和胰腺癌患者的组织样品中，以及在大多数乳癌、肺癌以及头颈癌患者中，CEA增加(Goldenberg，D.M.，et al.，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。CEA水平提高在非恶性患者中也有报道，而许多结直肠癌患者血清中的CEA水平正常，尤其是在疾病早期(Carriquiry，L.A.，and Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.，et al.，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，et al.，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。由血清或血浆检测的CEA在检测重现性方面的效用在报道上有争议，迄今还未广泛应用(Martell，R.E.，et al.，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.，et al.，JAMA 270(1993)943-947)。
根据可得到的数据，血清CEA测定过程所具有的敏感性和特异性均不能使其用作无症状群体的结直肠癌筛选检查(Reynoso，G.，et al.，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血浆是最广泛使用的临床途径样品源。鉴别出使癌症检查可靠或提供早期诊断信息的早期CRC肿瘤标记物，可产生一种诊断性实验，极大地帮助诊断和处理该疾病。因此，存在着急迫的临床需要来改进CRC的血液诊断。特别重要地是改善CRC的早期诊断，因为对于早期诊断的患者来说，其存活机会远高于在疾病进行期被诊断出来的患者。
本发明的任务是研究是否可以鉴别出可能有助于CRC诊断的新标记物。
令人惊奇地是，已经发现使用蛋白PSE3至少可以部分地克服目前技术水平已知的问题。
因此，本发明涉及结直肠癌诊断方法，该方法包括以下步骤a)提供由个体获得的液体样品；b)在适于PSE3特异性结合物和PSE3形成复合物的条件下，使所述样品接触所述结合物，和c)将(b)中形成的复合物的量与结直肠癌诊断相关联。
本发明的另一个实施方案是诊断结直肠癌的方法，该方法包括以下步骤a)在适于PSE3特异性结合物和PSE3形成复合物的条件下，使得自个体的液体样品接触所述PSE3特异性结合物，和b)将(a)中形成的复合物的量与结直肠癌诊断相关联。
技术人员应当认识到，任何这样的诊断都可以体外进行。其后废弃患者样品。患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，患者样品材料不转移回患者体内。通常，样品为液体样品。
26S蛋白酶体是一种具有高度有序结构的多催化蛋白酶复合体，由两种复合体20S核心和19S调节体组成。蛋白酶体以高浓度分布于整个真核细胞中，以ATP/泛蛋白依赖性方式切割肽(Coux et al.(1996)，Annu.Rev.Biochem.65，801-847；Bochtler et al.(1999)，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.28，295-317)。免疫蛋白酶体是一种改良的蛋白酶体，其是加工MHC I类肽必须的。在免疫蛋白酶体中，19S调节体由11S调节体取代(Rock and Goldberg(1999)，Annu.Rev.Immunol.17，739-779)。已经鉴别出11S调节体的3种亚基(α、β和γ)(Kandil et al.(1997)，Immunogenetics 46，337-344)。PSE3(蛋白酶体激活蛋白亚基3；SWISS-PROTQ12920)是11S调节体的γ亚基，6个γ亚基组合形成同源六聚体环。
已经鉴别出编码不同同工型的两种转录物变体(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
最初在1990年分离出PSE3编码基因，对应的蛋白称为Ki。系统性红斑狼疮(SLE)患者产生抗多种核抗原的自身抗体，Ki是其中之一。Nikaido等(Nikaido et al.(1990)，Clin.Exp.Immunol.79，209-214)使用牛cDNA作为探针筛选SLE患者cDNA文库，分离出对应的cDNA。稍后，发现重组Ki活化蛋白酶体，该蛋白被确定为PSE3(Realini et al.(1997)，J.Biol.Chem.272，25483-25492；Tanahashi et al.(1997)，Genes Cells2，195-211)。
最近的工作揭示，根据免疫组织化学染色和蛋白质印迹的评价，PSE3在甲状腺癌中不正常高表达，尤其是在其生长促进细胞中不正常高表达(Okamura et al.(2003)，J.Clin.Endocrin.Metab.88，1374-1383)。
对技术人员来说显而易见地是，本发明不应当被解释为限于SEQID NO1或SEQ ID NO2的全长PSE3蛋白。PSE3的生理或人工片段、PSE3的次级修饰物以及PSE3的等位基因变体也包含在本发明中。人工片段优选包括合成或通过重组技术产生的肽，其至少包含诊断目标的一个表位，该表位由至少6个连续氨基酸组成，这6个连续氨基酸来源于在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中公开的序列。这样的片段最好可用于产生抗体，或用作免疫实验中的标准。人工片段更优选包含目标的至少两个表位，以供建立夹心免疫实验。
在优选的实施方案中，新标记物PSE3可用于监测以及筛选目的。
当用于患者监测时，本发明的诊断方法可能有助于评价肿瘤载荷、治疗效率和患者随访中肿瘤复发。PSE3水平增加与肿瘤载荷直接相关。在短期(几小时至14天)化疗后，PSE3增加可用作肿瘤细胞死亡指标。在患者随访(3个月至10年)中，PSE3增加可用作肿瘤复发指标。
在一个优选实施方案中，本发明的诊断方法用于筛选目的。即其通过检测PSE3水平，并将所检测的水平与CRC的存在与否相关联，用于评价预先未进行CRC诊断的患者。
结直肠癌最经常由腺瘤(息肉)发展为恶性肿瘤。CRC的不同分期常常按照Dukes的A-D期分期。
癌症分期是根据程度、发展和严重性对疾病分级。其将癌症患者分组，以使预后和治疗选择普遍化。
目前，TNM系统最广范地被用于对癌症的解剖学程度进行分期。其代表了国际公认的一致的分期系统。有三种基本变量T(原发肿瘤程度)、N(区域淋巴结状况)和M(有或没有远处转移)。TNM标准公开于UICC(International Union Against Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(eds)TNM Classification of Malignant Tumours，fifthedition，1997。
尤其重要地是，CRC的早期诊断转化为非常好的预后。结直肠恶性肿瘤由良性肿瘤产生，即由腺瘤产生。因此，最好的预后是那些在腺瘤阶段确诊的患者。早在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0期确诊的患者如果治疗适当的话，其在诊断后存活5年的几率超过90％，相比之下已出现远处转移时确诊的患者的5年存活率只有10％。
在本发明的意义上，CRC的早期诊断是指在恶性前肿瘤状态(腺瘤)或在根本未出现转移(无论是邻近还是远距离，即腺瘤、T1S、N0、M0或T1-4、N0、M0)的肿瘤期确诊。T1S代表原位肿瘤。
在一个优选的实施方案中，PSE3用于诊断早在腺瘤期的CRC。
进一步优选诊断出CRC时其尚未完全生长过肠壁，因此既没有使腹膜脏层穿孔，也没有侵入其它器官和结构，即在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0(＝T1S-3、N0、M0)期确诊。
本发明的诊断方法基于个体来源的液体样品。与本领域已知的方法不同，PSE3是通过使用特异性结合物由该液体样品中特异性检出。
特异性结合物为例如PSE3受体、结合PSE3的凝集素或PSE3抗体。特异性结合物与其对应靶分子的亲和性至少为107l/mol。特异性结合物与其靶分子的亲和性优选为108l/mol，或更优选为109l/mol。技术人员应当认识到，术语特异性用于表示样品中存在的其它生物分子不明显结合PSE3特异性结合物。结合靶分子以外的生物分子的水平产生的结合亲和性优选仅为靶分子亲和性的10％，更优选仅为靶分子亲和性的5％或更少。最优选的特异性结合物既实现以上的亲和性最低标准，也实现特异性最低标准。
特异性结合物优选为PSE3反应性抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这些抗体的片段以及含抗体结合结构域的遗传构建物。
任何保持以上特异性结合物标准的抗体片段都可以使用。抗体通过本领域公开的方法生产，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)全书，尤其是第43-78页；Elsevier，Amsterdam)描述的方法。另外，技术人员完全了解基于免疫吸收剂的方法可用于抗体的特异性分离。利用这些方法可提高多克隆抗体的质量，并由此增强其在免疫实验中的效能(Tijssen，P.，出处同上，108-115页)。
为实现本发明公开的内容，使用在兔中产生的多克隆抗体。但是，很明显，也可以使用其它物种例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆抗体可以需要的任意量生产，并具有稳定的特性，所以它们是开发临床途径实验的理想工具。在本发明方法中，PSE3单克隆抗体的生产和使用是又一个优选实施方案。
现在，技术人员应当认识到，PSE3已经被确定为有效诊断CRC的标记物，使用替代方法可达到和本发明成果相当的结果。例如，可使用替代策略生产抗体。这样的策略其中包括使用合成肽，该肽具有PSE3表位，用于免疫。或者，可使用又称为DNA接种的DNA免疫。
为进行检测，在适于形成结合物-PSE3复合体的条件下，使得自个体的液体样品和PSE3特异性结合物温育。这样的条件不必指定，因为技术人员不需要创造性劳动就可以轻易确定这样的合适温育条件。
作为本发明公开方法的最后一步，检测复合体的量，并将其与CRC诊断相关联。技术人员应当认识到，有众多方法来检测特异性结合物-PSE3复合体的量，其全部细节都描述在相关的教科书(参阅例如Tijssen P.，出处同上，或Diamandis，et al.，eds.(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)中。
优选以夹心型实验形式检测PSE3。在这样的实验中，使用第一种特异性结合物将PSE3捕获在一侧，在另一侧使用第二种特异性结合物，其被标记得可直接或间接检测。
如上所述，已经令人惊奇地发现，可检测得自个体样品的液体样品中的PSE3。在CRC诊断中应用标记物PSE3不需要组织和活组织检查样品。
在一个优选实施方案中，用血清作为液体样品材料实施本发明的方法。
在进一步优选的实施方案中，用血浆作为液体样品材料实施本发明的方法。
在进一步优选的实施方案中，用全血作为液体样品材料实施本发明的方法。
此外，可以技术人员已知的各种方法制备粪，同样获得液体样品。这种来源于粪的样品液体也代表了本发明的优选实施方案。
对组织样品应用常规蛋白酶体方法导致鉴别出选定组织的多种潜在标记侯选物，但本发明的发明人令人惊奇地能检测体液样品中的蛋白PSE3。甚至更令人惊奇地是，他们能够证明，在得自个体的这种液体样品中存在的PSE3可与结直肠癌诊断相关联。
具有巨大优势的PSE3抗体可用于建立方法，例如在原位、活组织检查中或免疫组织学方法中检测结直肠癌细胞。
PSE3抗体优选用于定性(PSE3存在与否)或定量(测定PSE3量)免疫实验。
检测蛋白PSE3水平已被证实在CRC领域非常有优势。因此，在进一步优选的实施方案中，本发明涉及使用蛋白PSE3作为标记分子，用于由得自个体的液体样品诊断结直肠癌。
术语标记分子用于表示根据个体体液检测，分析物PSE3的水平增加标志着存在CRC。
特别优选在结直肠癌的早期诊断中使用新标记物PSE3。
蛋白PSE3本身的使用代表着挑战CRC诊断领域的显著进步。联合检测PSE3和其它已知标记物如CEA或迄今已发现的其它CRC标记物，获得了进一步的改进。因此，在进一步优选的实施方案中，本发明涉及在由得自个体的液体样品诊断结直肠癌时联合使用为结直肠癌标记分子的PSE3和一种或多种结直肠癌标记分子。在这点上，表述“一种或多种”代表1-10种，优选1-5种，更优选3种。可与PSE3检测组合的其它CRC标记物优选为CEA、CA 19-9、CA 72-4和/或CA 242。因此，本发明非常优选的实施方案是在由得自个体的液体样品诊断结直肠癌时使用为结直肠癌标记分子的蛋白PSE3连同一种或多种结直肠癌标记分子，其中至少一种其它标记分子选自CEA、CA 19-9、CA 72-4和CA 242。非常优选标记物PSE3和CEA联用。
在特异性结合实验如免疫实验领域中的诊断试剂，通常最好以试剂盒的形式提供，其含有特异性结合物和进行实验需要的辅助试剂。本发明因此还涉及免疫学试剂盒，其含有至少一种PSE3特异性结合物和用于检测PSE3的辅助试剂。
检查的受试者操作特征曲线(ROC)最好地描述了检查的准确度(特别参见Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是全部敏感性/特异性对的曲线，其由观测数据完整范围内不断变化的判断阈值产生。
实验室检查的临床效能取决于其诊断准确度或正确将患者分类成临床相关亚组的能力。诊断准确度衡量检查正确分辨所研究患者的两种不同状况的能力。这样的状况例如为健康和疾病或良性对恶性疾病。
在每种情况下，通过在完整判断阈值范围内画出敏感性对1-特异性的曲线，ROC图都描绘出了两种分布之间的重叠。在y轴上为敏感性或真阳性率[定义为(真阳性检查结果数)/(真阳性检查结果数+假阴性检查结果数)]。这也称为在疾病或病症存在下的阳性。其仅仅是由受感染亚组计算出来。在x轴上为假阳性率，或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)]。其是特异性的指标，完全由未感染亚组计算出来。因为真阳性和假阳性率完全独立地通过使用两个不同小组的检查结果计算出来，所以ROC曲线与样品中疾病的发病率无关。ROC曲线上的每个点都代表对应于特定判断阈值的敏感性/-特异性对。具有理想辨别力的检查(两种分布结果之间无重叠)的ROC曲线经过左上角，其真阳性率为1.0，即100％(理想的敏感性)，而假阳性率为0(理想的特异性)。无辨别力的检查(两组的分布结果一致)的理论曲线为从左下角至右上角的45°对角线。大多数曲线处于这两个极端之间。(如果ROC曲线完全处于45°对角线以下，则其很容易通过将“阳性”标准由“大于”转变为“小于”而矫正，反之亦然)。定性地看，曲线越接近于左上角，检查的整体准确度越高。
定量实验室检查的诊断准确度的一个便利目标是以单个数字表示其效力。最常见的整体检测是ROC曲线下面积。根据惯例，该面积经常≥0.5(如果不是，可倒转决策规则使其是)。值位于1.0(两组的检查值完全分开)和0.5(两组检查值之间没有显著的分布差异)之间。面积不仅仅取决于曲线的特定部分，例如最接近对角线的点或90％特异性的敏感性，而是取决于整条曲线。这是ROC曲线如何接近理想曲线(面积＝1.0)的定量描述性表达。
使用受试者操作特征曲线分析(ROC；Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)，评价新标记物PSE3与已确立的标记物CEA相比或组合的临床效用。该分析基于意义明确的患者群，其由50个各自分别得自T1-3、N0、M0期患者、更恶化的肿瘤即T4和/或各种严重程度的转移(N+和/或M+)以及健康对照的样品组成。
提供以下的实施例、参考文献、序列表和图是为了帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求书中提出。要理解地是，可对所提出的方法进行修改，而不偏离本发明的精神。
图1结肠肿瘤组织中PSE3的鉴别，其表观分子量约为30kDa，等电点约为pH 5.5(较高处)。图1显示了用肿瘤样品上样的2D-凝胶(左侧)和用得自邻近健康粘膜的相配对照样品上样的凝胶(右侧)的典型实例。这些凝胶的放大部分中的图表示蛋白PSE3的位置。该蛋白用相同方法在健康粘膜中无法检测到。标示的蛋白斑在对照和肿瘤组织中以相同的程度明显存在。这是由于以下事实经常在和肿瘤组织中的ANX4(膜联蛋白4)相同的蛋白斑处鉴别出PSE3。PSE3(剪接变体2)(31kDa/5.79)和ANX4(35kDa/5.85)的MW和PI非常相似，这解释了这种表观上的共迁移。PSE3从未在该蛋白斑中被鉴别出来，也没有在对照凝胶中的任何其它蛋白斑中被鉴别出来，但PSE3专门在肿瘤组织中表达。
图2蛋白质印迹的典型实例。用4名患者(患者34结肠癌，DukesB；患者36直肠癌，Dukes B；患者37直肠癌，Dukes A；和患者39结肠癌，Dukes A)的结直肠肿瘤组织和邻近健康对照组织的组织裂解物上样聚丙烯酰胺凝胶，在电泳后将蛋白印迹在硝酸纤维素膜上。使用多克隆兔抗PSE3血清测试样品中PSE3的存在情况。含肿瘤裂解物的泳道用“T”表示，含正常对照组织的泳道用“N”表示。箭头表示凝胶中PSE3条带的位置。所有的肿瘤样品都在PSE3位置产生强烈信号，而在邻近正常对照组织的裂解物中仅可检测到微弱信号。
简写ABTS 2，2′-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐BSA 牛血清白蛋白cDNA 互补DNACHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸盐)DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA酶联免疫吸附实验HRP 辣根过氧化物酶IAA 碘乙酰胺IgG 免疫球蛋白GIEF 等电聚焦IPG 固定化pH梯度LDS 十二烷基硫酸锂MALDI-TOF基体辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱MES 三甲苯基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS 磷酸缓冲盐水PI 等电点RTS 快速表达系统SDS 十二烷基硫酸钠实施例1鉴别PSE3为潜在的结直肠癌标记物组织来源为鉴别作为潜在结直肠癌诊断标记物的肿瘤特异性蛋白，使用蛋白酶体方法对三种不同组织进行分析。
总而言之，分析10名患结直肠癌的患者的组织标本。对于每名患者，由治疗性切除物收集三种不同的组织类型肿瘤组织(＞80％肿瘤)(T)、邻近健康组织(N)和邻近健康粘膜的剥离粘膜(M)。后两种组织类型用作相配的健康对照样品。在切除后立即将组织速冻，并在处理前储存于-80℃。用组织病理学标准诊断肿瘤。
组织制备将0.8-1.2g冷冻组织放入臼中，并利用液氮完全冷冻。将组织在臼中研磨成粉，并溶解在10倍体积(w/v)的裂解缓冲液(40mM柠檬酸钠、5mM MgCl2、1％ Genapol X-080、0.02％叠氮化钠、无EDTA的Complete[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号1873580])中，随后在Wheaton玻璃均质机(20x松配合(fitting)，20x紧配合)中匀浆。以4500xg对3ml匀浆液进行1小时的蔗糖密度离心(10-60％蔗糖)。在此离心步骤后，获得三种组分。梯度顶层级分含可溶性蛋白，将其用于进一步的分析。
等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE对于IEF，将3ml悬浮液与12ml样品缓冲液(7M尿素、2M硫脲、2％ CHAPS、0.4％ IPG缓冲液pH 4-7、0.5％ DTT)混合，并温育1小时。将样品在AmiconUltra-15装置(Millipore GmbH，Schwalbach，Germany)中浓缩，使用Bio-Rad蛋白实验(目录号500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，Germany)按照供应商的说明测定蛋白浓度。向相当于1.5mg蛋白样品的体积中加入缓冲液，至终体积为350μl。该溶液用于过夜再水合IPG条带pH 4-7(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。使用以下的梯度方案进行IEF1.)1分钟达到500V；2.)2小时达到3,500V；3.)3,500V稳定22小时，产生82kVh。在IEF后，将条带储存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE。
在SDS-PAGE前，将条带在平衡缓冲液(6M尿素、50mMTris/HCl、pH 8.8、30％甘油、2％ SDS)中温育，对于还原，加入DDT(15分钟，+50mg DTT/10ml)，对于烷基化，加入IAA(15分钟，+235mg碘乙酰胺/10ml)。将条带放在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上，并以1W/凝胶电泳1小时，然后以17W/凝胶电泳。随后，固定(50％甲醇、10％乙酸盐)凝胶，并用NovexTM胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目录号LC6025，45-7101)染色过夜。
检测为结直肠癌潜在标记物的PSE3通过用ProteomeWeavers软件(Definiens AG，Germany，Munchen)进行影像分析，独立地分析每名患者。另外，凝胶的所有蛋白斑都通过挑选机器人切除，蛋白斑中存在的蛋白通过MALDI-TOF质谱鉴别(UltraflexTMToF/ToF，Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)。对于每名患者，将肿瘤样品的4个凝胶与邻近正常和剥离粘膜组织的各自4个凝胶进行对比，并分析对应于差异表达蛋白的不同蛋白斑。利用这种方法，发现蛋白PSE3在肿瘤组织中特异性表达或强烈过表达，而在健康对照组织中未检测到或不太强烈地表达。因此，其和许多其它蛋白一道，有资格成为用于结直肠癌诊断的候选标记物。
实施例2生产结直肠癌标记蛋白PSE3的抗体生产结直肠癌标记蛋白PSE3的多克隆抗体，通过免疫检测实验如蛋白质印迹或ELSIA，进一步使用这些抗体检测血清、血浆和血液的PSE3水平。
在大肠杆菌中表达的重组蛋白为了生产抗PSE3抗体，进行蛋白重组表达，以获得免疫原。使用RTS 100表达系统和大肠杆菌的组合进行表达。在第一步中，分析DNA序列，使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系统获得推荐的高产量cDNA沉默突变体和各自的PCR引物序列。这是一个基于商业站点的服务(www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，使用“RTS100大肠杆菌线性模板生产装置，His-tag”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号3186237)系统，由cDNA生产线性PCR模板，用于PSE3蛋白编码核苷酸序列的体外翻译和表达。为了蛋白质印迹检测和随后的纯化，表达的蛋白含His-tag。鉴别出最佳表达的变体。由PCR至表达和检测的所有步骤都按照生产商的说明进行。各自的PCR产物含所有必需的T7调节区(启动子、核糖体结合位点和T7终止子)，按照生产商的说明将其克隆入pBAD TOPO载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目录号K 4300/01)中。为使用T7调节序列进行表达，将构建物转化入大肠杆菌BL 21(DE 3)(Studier，F.W.，et al.，Methods Enzymol.185(1990)60-89)中，转化的细菌以1L批次培养，用于蛋白表达。
按照标准方法在Ni-螯合柱上进行His-PSE3融合蛋白纯化。简而言之，通过离心沉淀1L含His-PSE3融合蛋白表达载体的细菌培养物。将细胞沉淀重悬浮在裂解缓冲液中，该裂解缓冲液含磷酸盐pH8.0、7M盐酸胍、咪唑和硫代甘油，接着使用Ultra-Turraxe匀浆。通过高速离心沉淀不溶性物质，将上清液上Ni-螯合层析柱。用几个柱床体积的裂解缓冲液冲洗柱，接着用含磷酸盐pH 8.0和尿素的缓冲液冲洗。最后，使用含SDS的磷酸盐缓冲液在酸性条件下洗脱结合的抗原。
生产抗PSE3的单克隆抗体a)免疫小鼠首先用100μg PSE3腹膜内免疫12周龄的A/J小鼠。在6周后接着再进行两次间隔1个月的腹膜内免疫。在此过程中，每只小鼠都给予100μg吸附至氢氧化铝的PSE3和109g百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。随后，每次使用100μg PSE3的PBS缓冲液在融合前第3天和第2天静脉内进行最后两次免疫接种。
b)融合和克隆按照Galfre，G.，and Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46所述，将按照a)免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在该过程中，将免疫小鼠的约1×108脾细胞与2×107骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并离心(300xg，10分钟，4℃)。然后用无胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基漂洗细胞1次，并在50ml圆锥管中以400xg再离心。废弃上清液，通过轻敲温和地使细胞沉淀松散，加入1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)，通过移液操作混合。在37℃水浴中1分钟后，于室温在4-5分钟内滴加5ml无FCS的RPMI 1640。此后，在约1分钟内滴加入5ml含10％ FCS的RPMI 1640，彻底混合，用培养基(RPMI 1640+10％ FCS)补充至50ml，随后以400xg于4℃离心10分钟。将沉淀的细胞由含10％ FCS的RPMI 1640中取出，并接种在次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸的RPMI 1640+10％ FCS溶液)中。向培养基中加入100U/ml的白介素6作为生长因子。
大约10天后，测试初级培养物的特异性抗体。利用荧光活化细胞分拣仪在96孔细胞培养板中克隆PSE3阳性初级培养物。在该过程中，再加入100U/ml的白介素6作为生长因子。
c)由细胞培养物上清液分离免疫球蛋白将获得的杂交瘤细胞以1×105细胞/ml密度接种在含10％ FCS的RPMI 1640中，并在发酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，型号MCS-104XL，序号144-050)中增殖7天。在培养物上清液中获得平均浓度为100μg/ml的单克隆抗体。通过蛋白质化学的常规方法(例如Bruck，C.，et al.，Methods in Enzymology 121(1986)587-695描述的方法)由培养物上清液进行此抗体的纯化。
生产多克隆抗体a)免疫接种为进行免疫接种，以1∶1比率制备蛋白溶液(100μg/ml蛋白PSE3)和完全弗氏佐剂的新鲜乳浊液。每只兔在第1、7、14和第30、60和90天用1ml乳浊液免疫接种。取血，获得的抗PSE3血清进一步用于实施例3和4描述的实验。
b)用辛酸和硫酸铵通过连续沉淀由兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)用4体积的乙酸盐缓冲液(60mM，pH 4.0)稀释1体积的兔血清。用2M Tris-碱将pH调节至4.5。在剧烈搅拌下滴加辛酸(25μl/ml的稀释样品)。30分钟后，离心样品(13,000xg，30分钟，4℃)，废弃沉淀，收集上清液。通过加入2M Tris-碱将上清液pH调节至7.5，并过滤(0.2μm)。
在剧烈搅拌下，通过滴加4M硫酸铵溶液至终浓度为2M，沉淀上清液中的免疫球蛋白。通过离心(8,000xg，15分钟，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
废弃上清液。将沉淀溶解在10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl中，并彻底透析。透析液进行离心(13,000xg，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
生物素化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl使多克隆兔IgG达到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml的DMSO溶液)。于室温30分钟后，在Superdex 200(10mMNaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl)上层析样品。收集含生物素化IgG的级分。按照相同的方法生物素化单克隆抗体。
地高辛配基化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl，pH 7.5使多克隆兔IgG达到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基辛酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号1 333 054)(3.8mg/ml的DMSO溶液)。于室温30分钟后，在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mMNaCl)上层析样品。收集含地高辛配基化IgG的级分。按照相同的方法用地高辛配基标记单克隆抗体。
实施例3使用实施例2生产的多克隆抗体以蛋白质印迹检测人结直肠癌组织中的PSE3如实施例1“组织制备”所述制备肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解物。
使用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对于测试的每种组织样品，将10μg组织裂解物稀释在还原性NuPAGE(Invitrogen)SDS样品缓冲液中，并于95℃加热10分钟。样品在MES电泳缓冲体系中在4-12％ NuPAGE凝胶(Tris-甘氨酸)上电泳。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE转移缓冲体系将凝胶分离的蛋白混合物印迹到硝酸纤维素膜上。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜3次，并用Roti-Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。初级抗体多克隆兔抗PSE3血清(如实施例2所述产生)用Roti-Block封闭缓冲液以1∶10,000稀释，并与膜温育1小时。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。用POD-缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记特异性结合的初级兔抗体，用0.5xRoti-Block封闭缓冲液稀释至10mU/ml。温育1小时后，用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。为检测结合的POD-缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-LightLUS蛋白质印迹底物(序号2015196，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)温育，并对放射自显影胶片曝光。
典型实验的结果示于图2。发现在检查的16名结直肠癌患者中，有15名患者其PSE3在肿瘤组织中相比于邻近对照组织强烈过表达。
实施例4ELISA用于检测人血清和血浆样品中的PSE3为检测人血清或血浆中的PSE3，开发了夹心ELISA。为捕获和检测抗原，将等份的抗PSE3多克隆抗体(参见实施例2)分别与生物素和地高辛配基缀合。
在10mM磷酸盐，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中，将链霉抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板与100μl的10μg/ml生物素化抗PSE3多克隆抗体温育60分钟。温育后，用0.9％NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。然后将孔与连续稀释的作为标准抗原的重组蛋白(参见实施例2)或稀释的患者血浆样品温育2小时。在结合PSE3后，用0.9％ NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。为特异性检测结合的PSE3，在10mM磷酸盐，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中将孔与100μl的10μg/ml地高辛配基化抗PSE3多克隆抗体温育60分钟。此后，漂洗板3次，以去除未结合的抗体。在下一步中，在10mM磷酸盐，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％Tween-20中将孔与20mU/ml抗地高辛配基-POD缀合物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号1633716)温育60分钟。随后用相同的缓冲液漂洗板3次。为检测抗原-抗体复合物，将孔与100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11685767)温育，在30-60分钟后用ELISA读数器于405nm检测OD。
实施例5根据诊断准确度评价临床效用的ROC分析通过分析得自特征明确的患者群的个体液体样品，评价准确度，所述特征明确的患者群即分别为50名进行结肠镜检查并发现无腺瘤或CRC的患者、50名确诊并分期为T1-3、N0、M0的CRC患者和50名确诊为进行性CRC的患者，进行性CRC患者至少在至少一个邻近淋巴结具有肿瘤侵润或具有更严重形式的转移。用市售可得的实验(Roche Diagnostics，CEA实验(目录号1 173 1629，用于ElecsysSystems免疫实验分析仪)检测CEA，并如上所述检测PSE3，由此定量得自这些个体每一个的血清中的CEA和PSE3。按照Zweig，M.H.，and Campbell(出处同上)所述进行ROC分析。通过正则化判别分析(Friedman，J.H.，Regularized Discriminant Analysis，Journal of theAmerican Statistical Association 84(1989)165-175)计算PSE3和已确立标记物CEA的组合区分T1s-3、N0、M0组患者和健康个体的判别力。
初步的数据表明，PSE3还可能对手术后患者的随访非常有帮助。
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序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>蛋白类蛋白酶体激活剂亚基3(PSE3)作为结直肠癌标记物的用途<130>21882<150>EP 03017582.2<151>2003-08-08<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>254<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>蛋白酶体活化蛋白亚基3，同工型<400>1Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80
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<220>
<221>MISC_FEATURE<223>蛋白酶体活化蛋白亚基3，同工型<400>2Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe85 90 95Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn100 105 110Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys Pro Glu Ile Arg Leu115 120 125Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Pro Ser Gly Lys Gly Pro His Ile Cys130 135 140Phe Asp Leu Gln Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile Pro Arg Ile145 150 155 160Glu Asp Gly Ash Ash Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu Thr Val Ala165 170 175
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1.一种结直肠癌的诊断方法，所述方法包括以下步骤a)提供得自个体的液体样品，b)在适于蛋白酶体激活蛋白亚基3(PSE3)特异性结合物和PSE3形成复合体的条件下，使所述样品与所述结合物接触，c)将(b)中形成的复合体的量与结直肠癌诊断相关联。
2.权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品是血清。
3.权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品是血浆。
4.权利要求1的方法，其进一步的特征在于所述样品是全血。
5.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自个体的液体样品进行的结直肠癌诊断中用作标记分子。
6.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自个体的液体样品进行的结直肠癌早期诊断中用作标记分子。
7.权利要求6的用途，其中所述早期诊断用来源于腺瘤期CRC患者的样品进行。
8.权利要求6的用途，其中所述早期诊断用来源于T1S-3、N0、M0期CRC患者的样品进行。
9.蛋白PSE3的用途，所述蛋白作为结直肠癌标记分子与另一种结直肠癌标记分子联用于由得自个体的液体样品进行的结直肠癌诊断。
10.一种免疫学试剂盒，所述试剂盒包含至少一种PSE3特异性结合物和用于检测PSE3的辅助试剂。
全文摘要
本发明涉及结直肠癌诊断。本发明公开了蛋白PSE3(蛋白酶体激活蛋白亚基3)在结直肠癌诊断中的用途。本发明涉及通过检测来源于个体的液体样品中的PSE3而由所述样品诊断结直肠癌的方法。PSE3检测例如可用于结直肠癌的早期检测或诊断。
文档编号G01N33/574GK1833170SQ200480022266
公开日2006年9月13日 申请日期2004年8月6日 优先权日2003年8月8日
发明者M·塔克, P·伯恩德特, M·-L·哈格曼, J·卡尔, H·兰根, S·帕尔梅, M·勒斯勒, W·罗林格尔, W·措尔格 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司