专利名称：早期预测急性冠脉综合症诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
该发明涉及早期预测急性冠脉综合症(ACS)的诊断试剂盒，具体的说是涉及以原核表达人可溶性CD40配体(sCD40L)蛋白为抗原，制备单克隆和多克隆sCD40L抗体；以HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物作为检测信号放大系统以检测血清sCD40L的超灵敏ELISA试剂盒，以用于ACS的心血管事件发生风险的
背景技术：
ACS是现今严重威胁人类生命和健康的常见病和多发病，因此早期预测该疾病的发生风险对临床上采取有效的防治措施具有重要意义。但目前对该疾病的临床控制却不够理想，主要原因是不能对ACS的发病作出早期发病风险预测，因而延误了对该病的治疗。诊断ACS，目前主要的生化检查是测定心肌坏死的标志物，包括酶类及肌钙蛋白(cTnT)，但这些标志物只能反应心肌坏死的程度或范围，而不能给临床提供有关心肌坏死前血栓形成阶段的病理生理信息。因此不能更早期预测ACS的发生风险。原核表达人可溶性CD40配体(sCD40L)蛋白是肿瘤坏死因子家族中的跨膜II型膜蛋白，以同源三聚体形式存在，与其受体CD40在动脉粥样硬化及血栓形成过程起重要作用。研究证实免疫细胞、血管内皮细胞及血小板都可以表达CD40和/或CD40L，而95％的血清sCD40L来源于活化的血小板，它的水平增高发生在患者临床症状出现之前，因此比其它指标更能早期地预测ACS冠脉事件的发生。事实上，已有大量研究表明sCD40L是良好的早期预测ACS发病风险的生化指标。由于其血清含量在“微克/升”水平，普通ELISA试剂盒已不能符合检测要求，所以目前迫切需要研制一种超灵敏检测sCD40L ELISA试剂盒，以大大改善临床治疗效果，提高患者治愈率。
发明内容
本发明的目的是开发一种超灵敏检测血清sCD40L ELISA试剂盒，以早期预测ACS的发病风险，大大改善临床治疗效果，提高患者治愈率。
本发明的技术方案在于一种早期预测急性冠脉综合症诊断试剂盒，包括sCD40L标准蛋白、sCD40L单克隆和多克隆抗体、封闭液、酶底物溶液、包被缓冲液、终止液、洗涤液及酶标板，其特征是以sCD40L标准蛋白为生化指标，用生物素标记的sCD40L单抗作为二抗标记物、用sCD40L多克隆抗体包被酶标板、以HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物作为检测信号放大系统。
所述的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L标准蛋白是采用基因工程法制备，该方法包括从淋巴细胞提取mRNA，针对sCD40L的膜外部分氨基酸52-261设计两对特异性引物，RT-PCR扩增，cDNA克隆入pGEM-T载体，测序确证后再亚克隆入N断带His标签的pET-28a原核表达载体，用IPTG诱导目的蛋白的表达，用亲和柱纯化。
所述的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L多克隆抗体是用原核表达纯化的His-sCD40L蛋白免疫兔子，以获得含sCD40L多克隆抗体的兔血清，先用(NH4)2SO4沉淀法初步纯化IgG，再用亲和层析柱进一步纯化，最后鉴定分离和纯化。
所述的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L单克隆抗体是将原核表达纯化的His-sCD40L蛋白免疫小鼠，得到抗原刺激的脾细胞，取脾细胞与SP2细胞融合，用HAT选择培养基选择杂交瘤细胞株，用ELISA法鉴定产sCD40L抗体的细胞，挑取抗体阳性的细胞株，单克隆化并扩大培养，细胞株注射小鼠腹腔，收集腹水，分装，冷冻保存。
所述的诊断试剂盒，其特征在于HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物是采用碳二亚胺法把HRP标记到活化的树枝状载体上，用过碘酸法将链亲和素标记到HRP-多聚赖氨酸复合物上，并层析纯化。
所述的诊断试剂盒，其特征是用生物素标记sCD40L单克隆抗体作为二抗，并纯化用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素标记试剂盒，按常用操作方法标记sCD40L单克隆抗体，透析去掉未标记的生物素，用Dot-ELISA法鉴定生物素标记效率。
所述的诊断试剂盒，其中封闭液是1％的白明胶溶液；酶底物溶液是TMB应用液，即60ug/ml TMB、0.045％ H2O2与0.1M pH6.0磷酸盐缓冲液的混合液；包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液即1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93gNaHCO3；终止液为2M H2SO4溶液；洗涤液为0.01M pH7.4的PBS缓冲液，其中含0.05％Tween-20，即1L溶液中含8gNaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4.12H2O，0.2gKCl、0.5ml Tween-20。
发明原理及积极效果分析该发明以原核表达人可溶性CD40配体蛋白sCD40L为生化指标，来早期预测ACS的发病风险。原理包括ACS的临床发病机理和上述基本研发技术，最终目的是研制出一种高效、超灵敏检测血清sCD40L水平ELISA试剂盒。
该发明用多抗包被ELISA板，不但节约了成本，而且简化了实验工序；用生物素标记的单抗作为二抗，以提高检测的特异性；以交联8分子并具有HRP酶活性的HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物作为检测信号放大系统，从而大大提高了检测的灵敏度。该发明通过检测sCD40L水平可早期预测ACS心血管事件的发生风险，能准确反映血栓形成阶段的病理生理信息，比常规反映心肌坏死的指标如酶类及肌钙蛋白(cTnT)等要早，因此达到早期诊断和预测的目的。研究证实，检测sCD40L水平可预测健康人及ACS患者心血管事件的发生风险，因此又可达到早期防治的目的，这也是临床医生期待实验工作者迫切需要解决的一个问题。超灵敏检测血清sCD40L水平ELISA试剂盒的研制正应和了此要求，并行将解决此问题，因此也必将产生巨大的社会及经济效益。
本发明实验结果及分析1、sCD40L标准蛋白的表达与纯化采用基因工程法制备sCD40L标准蛋白从淋巴细胞提取mRNA，针对sCD40L的膜外部分氨基酸52-261设计两对特异性引物，RT-PCR扩增。cDNA克隆入pGEM-T载体，测序确证。再亚克隆入N断带His标签的pET-28a原核表达载体，用IPTG诱导目的蛋白的表达；经SDS-PAGE鉴定，在39KD处有一条蛋白带(图1)；同时经Western Blotting发现只在39KD处有一条蛋白带(图2)，表明得到的蛋白为目的蛋白。该发明利用基因工程的方法制备sCD40L标准蛋白，取代了从血清直接分离纯化sCD40L的方法，不仅取材容易，而且简化了操作过程，节省了实验耗费。
2、抗sCD40L抗体的制备与纯化1)抗sCD40L单克隆抗体的制备及纯化该发明制备了高亲和力、高特异性、高效价的单抗IgG，利用(NH4)2SO4沉淀法和SPA-Sepharose亲和层析柱从杂交瘤细胞培养上清液中分离纯化后得到抗sCD40L单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定，在67KD和42KD处有两条蛋白带，分别为IgG的重链和轻链；同时经WesternBlot鉴定可与纯化的sCD40L标准蛋白杂交，表明分离纯化所得到的IgG为特异性抗sCD40L单克隆抗体。
2)抗sCD40L多克隆抗体的制备及纯化该发明利用(NH4)2SO4沉淀法和sCD40L-Sepharose亲和层析柱从兔血清中分离纯化得到高特异性、高亲和力和高效价的抗sCD40L多克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定，在67KD和42KD处有两条蛋白带，分别为IgG的重链和轻链，同时经Western Blot鉴定可与纯化的sCD40L标准蛋白杂交，表明分离纯化所得到的IgG为特异性抗sCD40L多克隆抗体。
3、抗sCD40L单克隆抗体及HRP-多聚赖氨酸复合物的标记用试剂盒(碳二亚胺法，Pierce产品)把HRP(辣根过氧化酶)标记到活化的树枝状多聚赖氨酸载体上，再用过碘酸法将链亲和素标记到HRP-多聚赖氨酸复合物上，用Dot-ELISA法检测酶复合物具有高酶活性；用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素标记试剂盒，按常用的操作方法标记抗sCD40L单克隆抗体，透析去掉未标记的生物素，经Dot-ELISA法鉴定，生物素的标记效率高。
4、用该发明开发的抗sCD40L多克隆抗体、生物素标记的抗sCD40L单克隆抗体及HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物制备血清sCD40L试剂盒，经精密度试验(批内，批间CV)，灵敏度试验(系列稀释法)，干扰试验(高脂血，溶血，黄胆的干扰)，回收试验(加入sCD40L标准品)，表明我们建立的超敏ELISA试剂盒具有高灵敏、高特异性。并测定223例健康成人、137例ACS患者的血清sCD40L水平，前者sCD40L浓度均小于0.52ng/ml；我们测定了137例经6个月随访的ACS患者的血清sCD40L水平，并统计其心血管事件的发生风险(见附表和附图)，事实上，我们的结果与临床观察结果高度一致，表明该指标可早期预测ACS心血管事件的发生风险，因而对早期防治ACS具有重要临床价值。
附表 6个月随访后发生死亡或非致命性心肌梗塞的风险比率筛选结果
图1不同时间ACS患者死亡或非致命性心肌梗塞的发生率图2sCD40L标准蛋白的表达与纯化。
蛋白Marker分子量为；18.4KD，29KD，43KD，68KD，97.4KD，200KD；sCD40L标准蛋白的分子量为39KD；图3Western Blot进一步鉴定sCD40L标准蛋白Western Blot鉴定sCD40L标准蛋白，在39KD处只有一条带。
具体实施例实施例1、克隆、表达、纯化、鉴定sCD40L从Gene Bank中搜索人sCD40L基因，并设计引物，经RT-PCR扩增后，将cDNA克隆入pGEM-T载体，测序确证。再亚克隆入N断带His标签的pET-28a原核表达载体，提取质粒，双酶切鉴定；鉴定正确的重组子转化BL21感受态细胞，提取质粒，双酶切鉴定；挑取含重组子菌落，37℃振荡培养，用IPTG诱导目的蛋白的表达；用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，优化表达条件，使目的蛋白以可溶的形式表达；大量表达目的蛋白，用NTA-Ni柱亲和柱纯化带His标签的目的蛋白，SDS-PAGE分离鉴定所表达的目的蛋白。
实施例2、制备、纯化、鉴定、标记抗sCD40L单克隆抗体原核表达纯化的His-sCD40L蛋白，免疫BALB/c小鼠隔3周后同样加强免疫二次，最后一次加强免疫后2周，取脾细胞与SP2细胞融合，HAT选择培养基，培养3周，取上清分别用纯化的His-sCD40L初步筛选单抗，然后用sCD40L蛋白包被的ELISA板检测抗体，分别挑取抗体阳性的细胞株，单克隆化，HT选择培养基培养三周后，取上清ELSIA法测抗体，阳性克隆株扩大培养，细胞株注射BALB/c小鼠腹腔，2周后，收集腹水，分装，-20℃，保存。Western Blotting和ELISA验证所制备的单抗。用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素标记试剂盒，按常用的操作方法标记抗sCD40L单克隆抗体，透析去掉未标记的生物素，经Dot-ELISA法鉴定，生物素的标记效率高。
实施例3、制备、纯化、鉴定抗sCD40L多克隆抗体用纯化的sCD40L蛋白免疫兔子，免疫2次，间隔1个月；取兔子全血，先利用(NH4)2SO4沉淀法从兔子的血清中初步纯化IgG，再用自制sCD40L-Sepharose亲和层析柱进一步纯化抗sCD40L的IgG，SDS-PAGE及Western Blot鉴定该多抗。
实施例4、用于超敏ELISA法测定血清sCD40L浓度时所需各种溶液的配制及操作步骤1)、酶底物溶液(TMB应用液)①TMB原液TMB 60mg，加入DMSO至10ml，4℃保存；②TMB应用液(现配)PBS缓冲液10ml+TMB原液100ul，30％H2O215ul；③0.1M pH6.0 PBS溶液；2)、包被缓冲液0.05M pH9.6 Na2CO3-NaHCO3溶液Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，用蒸馏水溶至1000ml；3)、洗涤液(pH7.4的PBS-Tween20溶液)NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 20 0.5ml，用蒸馏水溶至1000ml，备用；4)、封闭液(1％白明胶溶液)白明胶1g，用洗涤液溶至100ml；5)、终止液(2M H2SO4溶液)将22.2ml 98％ H2SO4浓缓慢加入177.3ml蒸馏水中，边加边搅动。
实施例5、制定标准曲线用包被液将纯化的抗sCD40L多克隆抗体稀释至1ug/ml，加入到96孔ELISA板板孔中，每孔100ul，4℃包被过夜；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体，加入1％白明胶封闭，每孔200ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体，加入不同浓度的sCD40L(0-20ug/l)的标准蛋白抗原，每孔100ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体；加入生物素标记的抗sCD40L单克隆抗体(用洗涤液稀释全1ug/ml)，每孔100ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体；加入HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物，每孔100ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗处显色5分钟，加入终止液，每孔50ul，用酶标仪在450nm处测定吸光度(A450)；以浓度(ug/l)为横坐标，A450为纵坐标，绘制标准曲线。
实施例6、测定血清sCD40L浓度于已包被好的ELISA板孔中加入100ul待检血清标本，室温下保温1小时，用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体；加入生物素标记的抗sCD40L单克隆抗体(用洗涤液稀释至1ug/ml)，每孔100ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体；加入HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物，每孔100ul，室温下保温1小时；用洗涤液洗板3次，甩干孔内液体，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗处显色5分钟，加入终止液，每孔50ul，用酶标仪在450nm处测定A450，根据标准曲线，求得血清sCD40L浓度。sCD40L的cut-off值为0.52ug/l，以此进行ACS心血管事件的风险评估。
权利要求
1.一种早期预测急性冠脉综合症诊断试剂盒，包括sCD40L标准蛋白、sCD40L单克隆和多克隆抗体、封闭液、酶底物溶液、包被缓冲液、终止液、洗涤液及酶标板，其特征是以sCD40L标准蛋白为生化指标，用生物素标记的sCD40L单抗作为二抗标记物、用sCD40L多克隆抗体包被酶标板、以HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物作为检测信号放大系统。
2.权利要求1的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L标准蛋白是采用基因工程法制备，该方法包括从淋巴细胞提取mRNA，针对sCD40L的膜外部分氨基酸52-261设计两对特异性引物，RT-PCR扩增，cDNA克隆入pGEM-T载体，测序确证后再亚克隆入N断带His标签的pET-28a原核表达载体，用IPTG诱导目的蛋白的表达，用亲和柱纯化。
3.权利要求1的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L多克隆抗体是用原核表达纯化的His-sCD40L蛋白免疫兔子，以获得含sCD40L多克隆抗体的兔血清，先用(NH4)2SO4沉淀法初步纯化IgG，再用亲和层析柱进一步纯化，最后鉴定分离纯化。
4.权利要求1的诊断试剂盒，其特征在于sCD40L单克隆抗体是将原核表达纯化的His-sCD40L蛋白免疫小鼠，得到抗原刺激的脾细胞，取脾细胞与SP2细胞融合，用HAT选择培养基选择杂交瘤细胞株，用ELISA法鉴定产sCD40L抗体的细胞，挑取抗体阳性的细胞株，单克隆化并扩大培养，细胞株注射小鼠腹腔，收集腹水，分装，冷冻保存。
5.权利要求1的诊断试剂盒，其特征在于HRP-多聚赖氨酸-链亲和素复合物是采用碳二亚胺法把HRP标记到活化的树枝状载体上，用过碘酸法将链亲和素标记到HRP-多聚赖氨酸复合物上，并层析纯化。
全文摘要
本发明公开了早期预测急性冠脉综合症(ACS)的诊断试剂盒，其组成是以sCD40L标准蛋白为生化指标、包括sCD40L单克隆和多克隆抗体、用生物素标记的sCD40L单抗作为二抗；用多sCD40L克隆抗体包被酶标板；以HRP－多聚赖氨酸－链亲和素复合物作为检测信号放大系统。本试剂盒是一种超灵敏检测血清sCD40L ELISA试剂盒，可以早期预测ACS的发病风险，大大改善临床治疗效果，提高患者治愈率。
文档编号G01N33/543GK1904616SQ200510036150
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月28日 优先权日2005年7月28日
发明者徐邦牢, 贝春花, 王蓉, 刘万里, 张革 申请人:广州市第一人民医院