专利名称：残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法
技术领域：
本发明涉及残粒样脂蛋白(remnant-like lipoprotein)中胆固醇的测定方法以及测定试剂。
背景技术：
近年来，伴随着高龄化，成人病的患病率一直急剧上升。众所周知动脉硬化在其中，特别是循环系统疾病，例如心脏病、脑血管系疾病(脑梗等)的发病中占重要位置。
一方面，胆固醇在血管壁的蓄积对动脉硬化症的发展起重要作用，其中涉及到血液中存在的各种脂蛋白。脂蛋白以胆固醇、胆固醇酯、中性脂肪、磷脂以及载脂蛋白为构成成分，在这些脂蛋白中，高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇被认为是动脉硬化症的危险因子的负因子，低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇被认为是动脉硬化症的危险因子的正因子，它们在临床检查领域被频繁测定。
但是，近年显示，与LDL中的胆固醇相比较，如残粒样脂蛋白的因脂质代谢等生成的脂蛋白中的胆固醇是作为动脉硬化症的危险因子的更加密切的指标。由于这种观点，高效、简便测定生物样品中脂蛋白中的胆固醇正在成为一个课题。
以往，关于残粒样脂蛋白中胆固醇的酶测定方法，有关于以下方法的报道(参考专利文献1和2，非专利文献1)，使用固定有脂蛋白中的构成载脂蛋白的抗体的凝胶、磷脂分解酶或者表面活性剂，提高测定的选择性，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶发挥作用，将胆固醇酯变换成胆固醇，再测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。
但是，在该方法中，在对残粒样脂蛋白的选择性、操作上的简便性·测定时间的长度等方面有优点也有缺点，不能说十分理想。
专利文献1日本专利特开平2001-231597号公报专利文献2日本专利第2949354号公报非专利文献1动脉硬化，25(9，10)，371(1998)
发明的揭示本发明的目的在于，提供更加简便且高精度测定残粒样蛋白质中胆固醇的方法以及进行该方法的试剂。
本发明人，根据上述情况，着眼于大多胆固醇酯酶除了具有酯酶活性之外，还具有脂蛋白脂肪酶活性，研究了各种测定脂蛋白中胆固醇时的条件，结果发现，选择与胆固醇酯酶活性相比较，脂蛋白脂肪酶活性的比率更高的胆固醇酯酶，在使用其和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测定脂蛋白中胆固醇时，对残粒样脂蛋白的选择性高，可以从高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、乳靡微粒(CM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、CM残粒、VLDL残粒、中密度脂蛋白(IDL)残粒等含有脂蛋白的生物样品中选择性测定残粒样脂蛋白中的胆固醇。
即，本发明涉及残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法，它是使含有脂蛋白的被测样品与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶作用，再通过测定生成的过氧化氢或还原型辅酶来测定脂蛋白中胆固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶。
另外，本发明涉及残粒样脂蛋白中胆固醇的测定试剂，其中含有脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶，以及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。
通过使用本发明的测定方法及测定试剂，可以极简便且灵敏度良好地在短时间内测定残粒样脂蛋白中的胆固醇。
图1使用LP酶时的LDL的反应特异性的显示图。
图2使用LP酶时的HDL的反应特异性的显示图。
图3本发明方法中，对非结合-VLDL、结合-VLDL的反应特异性的显示图。
图4添加抗体时，对非结合-VLDL及结合-VLDL的反应性的显示图。
图5本发明测定方法及已有的测定方法(RLP-II)中，测定血液中的残粒样脂蛋白的相关性的显示图。
具体实施例方式
本发明的残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法是使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶起作用，再测定生成的过氧化氢或还原型辅酶的方法，其中使用了脂蛋白脂肪酶(LPL)与胆固醇酯酶(CE)的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶。
众所周知，胆固醇酯酶是将脂蛋白中含有的胆固醇酯加水分解，从而生成胆固醇的酶，但是大多数的该酶除了具有该酯酶活性之外，还具有脂蛋白脂肪酶活性，即加水分解中性脂肪的脂肪酶活性。本发明中，必须使用脂蛋白脂肪酶活性较胆固醇酯酶活性更强的酶，具体使用脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶，通过这样，该酶选择性与残粒样脂蛋白作用，将该蛋白质中的胆固醇酯选择性加水分解，结果，可以选择性地仅测定目标残粒样脂蛋白中的胆固醇。
在此，脂蛋白脂肪酶活性指的是通过使用了橄榄油乳的脂蛋白脂肪酶活性分析法算出的活性单位(Horiuchi Y.et al.J Biochem 1976；80367-370.)、胆固醇酯酶活性是指通过使用了小牛血清的CEN活性分析法算出的活性单位(KamenoY.et al.Jap J Clin Path 1976；24650.)。
脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性(以下也简称为“活性比率”))为12～7000，优选为20～1000，更优选为28～800。
作为具有所述活性比率的胆固醇酯酶，可例举如LP(旭化成药业公司制、活性比率460～800)、LPBP(旭化成药业公司制、活性比率5600～6900)、CEN(旭化成药业公司制、活性比率13.0～16.0)、CE(天野酶公司制、活性比率13.0～16.0)、COE311(东洋纺公司制、活性比率28.0～35.0)或者与这些具有同等活性比率的酶。
该胆固醇酯酶只要是满足该条件的酶，可以是来自微生物或来自动物的任一种。
另外，胆固醇酯酶的使用量依赖于被测样品中的残粒样脂蛋白的含量或物理性状，通常使用0.1～200单位/mL即可，优选可以在1～100单位/mL的范围内使用。通常，对于健康人，可以在1～5单位/mL左右得到良好的测定结果。
另外，高脂血症患者中优选使用50单位/mL以上，特别是对于一直以来希望具有简便的测定方法的III型家族性高脂血症患者。另外确认了，一般来说健康孕妇的血中胆固醇值上升，如果使用本发明的胆固醇酯酶，能够以20单位/mL的用量得到良好的测定值。
本发明的残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法中，可以用抗载脂蛋白B-100抗体、抗载脂蛋白A-I抗体对被测样品施加前处理。通过添加所述的抗体，可以提高胆固醇对构成成分具有载脂蛋白B-100的LDL、VLDL以及构成成分具有载脂蛋白A-I的HDL、CM的胆固醇酯酶的选择性。
所述抗体处理技术在日本专利第2949354号公报中被公开了，然而，作为操作方法通过向被测样品中添加抗体结合凝胶再放置数小时，将残粒样脂蛋白与其它脂蛋白(HDL、LDL、VLDL、CM)分离，因此胆固醇酯酶的选择性继发性地提高。但是，如果使用本发明的胆固醇酯酶，没有必要将抗体用凝胶固定化，仅仅添加该抗体，就可以抑制该酶对残粒样脂蛋白以外的脂蛋白的作用，结果可以提高对残粒样脂蛋白的选择性。因此，在上述方法中，必须在添加凝胶固定化抗体之后长时间静置，而根据本发明的方法，可以通过抗体和脂蛋白的结合达到目的，因此可以在添加后数分钟就进行后续的操作，因而在操作方法的简便性·测定精度·时间的缩短的方面得到飞跃的改善。
作为使用抗体，只要是对载脂蛋白B-100或载脂蛋白A-I的抗体，就没有特别的限定，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体或它们的组合的任一种，作为一个示例，可例如作为载脂蛋白B-100识别抗体的JI-H(日本抗体研究所制)、作为载脂蛋白A-I识别抗体的H-12(日本抗体研究所制)。另外，由于抗体添加量依赖于被测样品中的HDL、LDL、VLDL或CM的量，因此只要添加能够与该脂蛋白相结合的量即可。
作为胆固醇氧化酶，只要是具有氧化胆固醇生成过氧化氢的能力的酶即可，没有特别的限定，可例举如来自微生物或动物的胆固醇氧化酶。
作为胆固醇脱氢酶，只要是具有氧化胆固醇还原氧化型辅酶能力的酶即可，没有特别的限定，可例举如来自微生物或动物的胆固醇脱氢酶。
上述胆固醇氧化酶及胆固醇脱氢酶的使用量在反应液中分别优选为0.01～200U/mL、更加优选为0.1～100U/mL。
在本发明的测定方法中，除了胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶之外，为了提高该酶的特异性、稳定性，还可以添加使用各种金属离子，特别是Ca离子。
另外，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶只要具有同等的活性，可以为被以聚乙二醇为主成分的基团、水溶性寡糖残基、磺丙基等化学修饰了的酶，也可以为由基因操作获得的具有同等活性的改良酶。
本发明的酶反应可以在水性介质中进行，特别优选在缓冲液中进行。
作为缓冲液，可例举如三(羟甲基)氨基甲烷、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂以及Good’s缓冲液等。作为Good’s缓冲液，可例举如N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺基)亚氨二醋酸(ADA)、N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、2-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N，N’-二(2-羟丙基-3-磺酸)(POPS)等。
另外，缓冲液的pH为4～10，优选为5～9。缓冲液的使用浓度优选为5～500mM，更优选为10～200mM，特别优选为20～100mM。
本发明的测定方法中，使用胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶时，通过胆固醇的反应由氧生成过氧化氢。生成的过氧化氢可以例如在过氧化物酶的存在下，使用4-氨酰安替比林基和酚类、4-氨酰安替比林和Trinder’s试剂或者高灵敏度的发色团(chromogen)来定量。
作为酚类，可例举如苯酚、4-氯酚、对甲酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作为Trinder′s试剂(同人化学研究所第19版总目录，2002年)，可例举如N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基替苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-m-甲苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-m-甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-m-茴香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基替苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-m-3-磺丙基-3-甲氧基苯胺(APPS)、N-乙基-N-3-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-2-羟基-3-磺丙氧基-3-甲氧基苯胺等苯胺类，或者N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-乙酰基乙二胺等。
作为高灵敏度的生色团，可例举如在日本专利特公昭60-33479号公报中揭示的10-(N-甲基氨甲酰基)-3，7-二(二甲氨基)酚噻嗪(MCDP)、日本专利特公平4-27839中揭示的二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]氨基(BCMA)、在日本专利特开昭62-296号公报中揭示的化合物等。作为这些生色团的浓度，优选为0.01～10mg/mL。
另外，使用胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶时，通过胆固醇的反应，由氧化型辅酶的NAD(P)生成还原型辅酶的NAD(P)H。可以通过测定在约300～500nm、优选为330～400nm、特别优选为约340nm下的反应液的吸光度，来定量NAD(P)H。另外，NAD(P)H的定量还可以通过添加心肌黄酶、四唑盐，生成甲 色素，再进行比色确定甲 色素来进行。
反应在10～50℃、优选为30～40℃、通常为37℃下进行1～30分钟、优选为2～10分钟即可。
本发明的试剂含有脂蛋白脂肪酶活性较胆固醇酯酶活性更强的胆固醇酯酶，以及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。
另外，例如在被测样品中存在大量残粒样脂蛋白以外的脂蛋白时等，为减小这些脂蛋白的影响而利用前述抗载脂蛋白B-100抗体及抗载脂蛋白A-I抗体进行前处理时，该试剂优选为包括含有该抗体的第1试剂、含有上述酶溶液的第2试剂。这时，优选为向被测样品中添加第1试剂，使之在25～40℃下反应1～10分钟之后，再添加第2试剂，使之在25～40℃反应2～20分钟。
另外，该测定试剂中还可以根据需要含有用于溶解生物样品中的球蛋白等蛋白质的各种盐类、脂蛋白促凝剂、其它酶等。
作为所述盐类，可例举如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁、酢酸镁、氯化锂、硫酸锂、硫酸铵、硝酸镁、硝酸钙等，可以使用0～100mM。作为脂蛋白促凝剂，可例举如磷钨酸盐、硫酸葡聚糖盐、肝素等聚阴离子，镁、钙、钴等2价金属盐。另外，作为其它酶，可例举如抗坏血酸氧化酶等。
另外，本发明中应用的被测样品没有特别的限定，具体地讲，在生物样品中可以使用全血或者血浆、血清等血液级分。
实施例以下，例举实施例更详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。
实施例1(1)试样的制备将血清成分分离成LDL级分及HDL级分，进行各脂蛋白的测定。该蛋白质的分离方法如下所示。
分别制备抗载脂蛋白B-100抗体结合亲和柱、抗载脂蛋白A-I抗体结合亲和柱，添加血清，回收结合级分，分别为LDL、HDL。
再利用离心分离法(Havel R.J.et al.J Clin InVest 1955；341345.、120000rpm，1.5hr，4℃)将VLDL的级分分离(全部-VLDL)后，在免疫吸附法(抗载脂蛋白B-100抗体结合亲和柱)中结合的级分为结合-VLDL，未结合而通过的级分为非结合-VLDL(残粒样脂蛋白成分)。在实施例2和3的测定时，使用胆固醇浓度调整至40mg/d的样品。
(2)测定试剂的制备如下所示，制备残粒样脂蛋白中的胆固醇测定试剂。
表1试剂1(抗体前处理时)Good’s缓冲剂pH6.8(PIPES，同仁化学公司制)50mMHDAOS(同仁化学公司制)1mM抗载脂蛋白B-100单克隆抗体(JI-H，日本抗体研究所制)100μg/mL抗载脂蛋白A-I单克隆抗体(H-12，日本抗体研究所制) 100μg/mL表2试剂2Good’s缓冲剂pH6.8(BES，同仁化学公司制) 50mM胆固醇酯酶LP(旭化成药业公司制)，或者CE(天野酶公司制) 20单位/mL4-氨酰安替比林(关东化学公司制) 3mM过氧化物酶(天野酶公司制) 10单位/mL胆固醇氧化酶(天野酶公司制) 6单位/mL(3)测定方法·结果进行抗体前处理时，将210μL的试剂1放入分光光度计的测定池，添加血清20μL搅拌之后，升温至37℃。接着，5分钟之后(反应点17)添加70μL事先加热到37℃的试剂2，在之后的5分钟(反应点33)内进行测定。在主波长572nm及副波长748nm的测定波长下进行测定。
以反应点17-33的吸光度变化率作为评价基准来进行评价。
实施例2(1)胆固醇酯酶对LDL及HDL的反应特异性将用0.1％的表面活性剂(Emulgen，花王公司制)处理后的LDL及HDL，以及没有处理的溶液作为被测样品，进行胆固醇的测定。使用LP酶(旭化成药业公司制、活性比率512)或者CE酶(天野酶公司制，活性比率14.3)作为胆固醇酯酶。将LDL示于图1，将HDL示于图2。测定方法如实施例1。两种情况均显示出，与胆固醇总反应量(表面活性剂处理)相比较，使用LP酶时的反应性显著降低。另外，使用CE酶时较LP酶显示更高的吸收。
实施例3(2)非结合-VLDL(残粒样脂蛋白级分)、结合-VLDL的反应特异性使用LP酶检测本发明测定方法中VLDL级分的反应特异性。另外，测定方法如实施例1。图3显示没有添加抗载脂蛋白B-100抗体(JI-H)及抗载脂蛋白A-I抗体(H-12)的反应性，图4显示添加了抗体的反应性。向第1液中添加抗体以使JI-H及H-12的终浓度均为100μg/mL。图3、图4中，非结合-VLDL及结合-VLDL均显示了大致相同的反应曲线，确认了可以选择性测定残粒样脂蛋白中的胆固醇。另外，添加抗体时，结合-VLDL的反应性进一步降低至约1/3，酶反应受到抑制。
因此，明确了可以通过添加抗体来更高精度地测定残粒样脂蛋白。
实施例4与市售残粒样脂蛋白中胆固醇测定试剂盒的比较(1)使用以往的残粒样蛋白质测定试剂盒(RLP-C II、日本抗体研究所社制)，以及各种胆固醇酯酶(LP活性比率512(旭化成药业公司制)、LPBP活性比率6296(旭化成药业公司制)、CEBPM活性比率11.2(东洋纺公司制)、CEN活性比率14.3(旭化成药业公司制)、COE311活性比率31.8(东洋纺公司制))，在与实施例3相同的条件下，测定VLDL级分中残粒样脂蛋白中的胆固醇，求其相关性。将结果示于表3。
结果确认了，使用除CEBPM之外的4种酶时，测定值与已有的市售试剂盒之间存在相关性。
表3
脂蛋白脂肪酶(LPL)活性由LP活性分析法(橄榄油乳)来测定。胆固醇酯酶(CE)活性由CE活性分析法(小牛血清)来测定。
(2)使用以往的残粒样蛋白质测定试剂盒(RLP-C II、日本抗体研究所公司制)以及本发明的测定方法(使用LP(旭化成药业公司制，活性比率512)作为胆固醇酯酶)，测定临床待测品的残粒样脂蛋白中的胆固醇，求其相关性。
将健康人14例、包括2例III型高脂血症的高脂血症患者20例、冠状动脉疾病患者65例的99例作为对象，利用RLP-C II法和直接RLP-C法同时测定，比较检测其相关性。结果得到回归曲线y＝0.987x+0.326、相关系数r＝0.962的良好的相关性(图5)。
权利要求
1.残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法，它是使含有脂蛋白的被测样品与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶作用，再通过测定生成的过氧化氢或还原型辅酶来测定脂蛋白中的胆固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为28～800。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，胆固醇酯酶选自LP、LPBP、CEN、CE及COE311。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，用抗载脂蛋白B-100抗体、抗载脂蛋白A-I抗体对被测样品进行前处理。
5.残粒样脂蛋白中的胆固醇测定试剂，其特征在于，含有脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶，以及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。
6.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为28～800。
7.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，胆固醇酯酶选自LP、LPBP、CEN、CE及COE311。
8.残粒样脂蛋白中的胆固醇测定试剂，其特征在于，包括含有抗载脂蛋白B-100抗体、抗载脂蛋白A-I抗体的第1试剂，以及含有权利要求5～7中任一项所述测定试剂的第2试剂。
全文摘要
本发明提供操作更加简便且高精度测定样品中的残粒样脂蛋白质中胆固醇的方法以及测定试剂。该残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法是使含有脂蛋白的被测样品与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶作用，再通过测定生成的过氧化氢或还原型辅酶来测定脂蛋白中的胆固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12～7000的胆固醇酯酶。
文档编号G01N33/92GK101065495SQ20058004071
公开日2007年10月31日 申请日期2005年11月28日 优先权日2004年11月29日
发明者中野隆光, 新见学, 荻原富美子 申请人:株式会社Jimro