专利名称：作为动脉粥样硬化诊断标记的核心2β(1，6)-乙酰葡糖胺基转移酶的制作方法
作为动脉粥样硬化诊断标记的核心2(5 (1,6)-乙酰葡糖胺基转移酶本发明涉及血管疾病特别是动脉粥样硬化的诊断方法领域。 已知动脉粥样硬化(AS)具有炎性成分，核心2 GlcNAc-T (也叫做 UDP-GlcNAc:Gaipi,3GalNAc-R (GlcNAc—GalNAc)卩l，6-N-乙酰氨難移酶或 核心邻l,6-N-乙酰氨基转移酶-EC2.4丄102)被认为与炎性过程相关(WO 0031109)。曾有人推测核心2 GlcNAc-T抑制剂在AS中可能有用(例如 WO0185748),然而，目前还没有公开的研究检测过动脉粥样硬化病人的核心2 GlcNAc-T的水平，也没有提示该酶的水平可以作为受试者动脉粥样5更化的标 记。本发明人惊奇的发现，患有动脉粥样硬化的病人，其血样中的核心2 GlcNAoT活性水平相对于非患病健康个体显著上升，因此，核心2 GlcNAc-T 的水平可以用于指示受试者中是否存在动脉粥样5更化。具体的，血样可以是包括多形核细胞-PMNs以及其他淋巴细胞亚群的分离 制品，更具体的，可以是包括PMNs和外周血单核细胞-PBMCs的制品。动脉粥样5更化包括(冠状动脉粥样硬俗冠状动脉疾病-CAD/缺血性心脏病 -1 0/动脉硬化性心血管疾病-八8(:\1)/冠状动脉性心脏病-(:00)。因此，本发明第一方面提供了一种指示受试者中是否存在动脉粥样石更化的 方法，其包括将来自受试者的组织样本中的核心2 GlcNAc-T水平与相同组织中 测定的参照水平进行比较。如果来自^i式者的组织样本中的核心2GlcNAc-T的 水平高于参照水平，则表明该受试者患有动脉粥样硬化。通常，组织中的参照水平M检测由一个或更多与不存在AS相关的个体 (one or more individuals associated with an absence of AS)组成的人群的组织样本 中的核心2GlcNAc-T的平均水平来建立；ftit的，组织中的参照水平M31检测 由五个或更多与不存在AS相关的个体组成的人群的组织样本中的核心2 GlcNAc-T的平均水平来建立；更itt的，组织中的参照水平Mil检测由十个或 更多与不存在AS相关的个体组成的人群的组织样本中的核心2 GlcNAc-T的平 均水平来建立。
方便地，组织样本是血液样本。方便地，可以采用本领域公知方法，在可从血液中分离得到的淋巴细胞中测定核心2 GlcNAc-T水平。具体而言，核心2 GlcNAc-T水平可通过检测包括PMNs以及其它淋巴细 胞亚群的分离制品来确定；更具体的，该分离制品包括PMNs以及PBMCs。核心2 GlcNAc-T水平可以是核心2 GlcNAc-T的RNA转录本水平，也可 以是核心2GlcNAc-T蛋白水平或者是核心2GlcNAc-T酶活水平；{雄的，它 是核心2 GlcNAc-T的酶活7JC平。^ft测核心2 GlcNAc-T酶活的合适方法包括采用方M性标记的底物或者受 体化合物，采用荧光标记的底物或受体化合物，或者在分析(例如通过HPLC) 之前衍生已形成的产品的那些方法，例如本发明描述的或者Chibber等，Diabetes 49 1724-1730 (2000); Palmenni C.A.等，Glycoconj J.Aug; 13 (4) :631-6 (1996); 或KuhnsW.等，Glycoconjugate Journal 10 381-394 (1993)(这些都以援引的方 式为本发明所包括)的方法。血样中淋巴细胞的分离以及核心2 GlcNAc-T活性 的测定，可以采用Chibber等(2000)中描述的方法，或者采用本发明实施例1 中所记载的方法。本发明人采用Chibber等(2000)中描述的方法或者实施例1中所详述的 方法，测定了来源于健康个体的淋巴细胞制品的核心2 GlcNAc-T酶活7X平为 40-1000 pmols/hr/mg蛋白，典型地在50-500 pmols/hr/mg蛋白之间。平均值可以在50到1000之间，典型i也在100到500之间，更为典型地是 在200400 pmol^hr/mg。当采用Chibber等(2000)中描述的方法或者实施例1中所详述的方法处 理血样以及检测淋巴细胞时，患有动脉粥样5更化个体的核心2 GlcNAc-T水平所 处的范围至少为健康非患病个体参照水平的两倍，优选的是至少四倍，更tt^ 的是至少六倍，最优选的是至少八倍。方便地，本发明所述的方法可以采用包含实施本发明所述的方法所必须的 成分的试剂盒来实现。因此，本发明的第二个实施方案中提供一种用于指示受 试者中是否存在动脉粥样硬化的试剂盒。优选盼瞎况下，该试剂盒包含受体化 合物。杨。、2GlcNAc-T能转运单糖残基至该受体化合物。优选的，该受体化合 物是Gal卩(1,3 )GalNAcoc的衍生物。适宜的受体化合物如Gal(3 (1,3 )GalNAc-Bn，
Galp (1，3) GaINAc-; -硝基苯酚，或者Gaip (1,3) Ga]NAcot-p-NHdansylphenyL任选的，试剂盒还可以包含有UDP-GlcNAc，其可以被方M性标记。方便 地，采用MC或者3H标记UDP《lcNAc。任选的，试剂盒还可以带有N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)以及淋巴细lfiia军试剂，如表面活性剂(如Tnton-X100)。试剂盒还可以带有指导使用的说明书。本发明将M参考以下的实施例、方案以及附图进行进一歩详述。根据这 些描述，本领域技术人员能想到落入权利要求范围内的更多实施方案。
图1图^i兑明来自健駒照个体与患有缺血性心脏病(腸)的患者的淋 巴细胞中的核心2GlcNAc-T的活性。对照组，n=19， IHD患者组，n=13。实施例1、测定分离自被诊断患有缺血性心脏病病人血液的淋巴细胞的核心2 GlcNAc-T活性本实验中使用了 13个患有IHD的两种性别的中年患者以及19个年龄匹配 的健^X寸照。患有糖尿病的患者被排除。本研究中包括的IHD患者患有稳定性 心绞痛以及非稳定性心绞痛，或者最近出现过心肌t體。血液采集入肝素化的试管中。血样被置于等体积的Histo-Paque 1077 (Pharmacia,百丁购自Sigma， Poole， Dorset,英国)层上，400g离心30分钟。 取淡黄色的薄层(Buflfycoat)(其中含有外周血单核细胞(PBMNC)以及多形 核(PMN)淋巴细胞)，在磷酸盐缓冲液中洗涤。分离得到的淋巴细胞冷冻，并 在0.9%的NaCl、 0.4%Tnton-X100、 1 mMPMSF中裂解，检测核心2 GlcNAc-T。 反应体系为50 mmo1/1的2- (N-吗啉代)乙磺酸，pH为7.0; 1 mmo1/1的 UDP-GlcNAc， 0.5 iiCi UDP-6[3H]-N-乙酰葡糖胺(16000 dpm/腿o1， NEN Life Science Products, Hounslow，英国)；0.1 mol/I GlcNAc; 1 mmol/l (3Dgal (1-3) Da-GalNAc-p-石肖基苯酚以及15ul的细)l^解液(100-200昭蛋白)，终体积为 30|nl。混合液在37。C温育1小时之后，加入1 ml的冰水终止反应，然后在C18 Sep-Pak柱(Waters-Millipore， Watford,英国)上处理。用20ml水洗涤柱子后， 以5 ml甲im脱产物并观糧鹏寸性。在不存在加入受体的情况下测量内源核心2GlcNAc-T活性。结果示于图l。健康个体中核心2 GlcNAc-T活性为287± 147.2pmols/hr/mg蛋白质，而患 有IHD的患者中为2376士461。这些数值与Clubber等(2000)的文献中的三组 健康个体的核心2GlcNAc-T活性相吻合，其中的值为249±35.9 (n=25)， 334 ±86 (n=ll)以及283士37 (n=31) pmols/hr/mg。
权利要求
1、一种指示受试者中是否存在动脉粥样硬化的方法，其包括将来自受试者的组织样本中的核心2 GlcNAc-T水平与相同组织中测定的参照水平进行比较。来自受试者的组织样本中的核心2 GlcNAc-T的水平高于参照水平，则表明该受试者患有动脉粥样硬化。
2、 权利要求1所述的方法，其中所述的组织样本是血样。
3、 权利要求1或2所述的方法，其中在淋巴细胞中检测所述的核心2 GlcNAc-T的水平。
4、 权利要求l-3任一项所述的方法，其中所述的淋巴细胞从血液中分离。
5、 权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述的核心2 GlcNAc-T水平是 核心2 GlcNAc-T酶活水平。
6、 权利要求l所述的方法，其中受试者淋巴细胞的核心2GlcNAc-T酶活 7JC平是参照7jC平至少2倍表明该受试者具有动脉粥样硬化。
7、 一种Mil检观赅心2 GlcNAc-T的酶活来指示受试者中是否存在动脉粥 样硬化的试剂盒，其包含有化合物，核心2 GlcNAc-T能够转运单糖残基至该化 合物。
8、 权利要求7所述的试剂盒，其中核心2GlcNAc-T能够转运单糖残基至 其上的化合物是G邓(1,3) GalNAc的衍生物。
9、 权利要求7或8任一项所述的试剂盒，其中核心2 GlcNAc-T會^多转运 单糖残基至其上的化合物是Gal卩(U) GalNAc-Bn， Gaip (1,3) GalNAc-，氨 基苯基，Gaip (1,3) GalNAc-户硝基苯酚，或者是Gaip (1,3) Ga!NAcot-p-NH 丹磺酰苯酚。
10、 权利要求3-5任一项所述的试剂盒，还包括UDP-GlcNAc。U、权利要求6所述的方法，其中所述的UDP-GlcNAc是方夂射性标记的。
全文摘要
本发明提供了一种指示受试者中是否存在动脉粥样硬化(特别是冠状动脉粥样硬化)的方法，其包括将来自受试者的组织样本中的核心2GlcNAc-T水平与相同组织中测定的参照水平进行比较。如果来自受试者的组织样本中的核心2GlcNAc-T的水平高于参照水平，则表明该受试者患有动脉粥样硬化(特别是冠状动脉粥样硬化-冠状动脉疾病-CAD)。在优选实施方式中，样本由淋巴细胞组成，通过使用放射性标记的UDP-GlcNAc以及Galβ(1，3)-GalNAc衍生物将蛋白水平确定为酶活性。
文档编号G01N33/68GK101213309SQ200680024415
公开日2008年7月2日 申请日期2006年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者R·奇伯 申请人:英国技术集团国际有限公司