专利名称：锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 锰离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对 人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在， 氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物 学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mi严和Mg^可互相替代。常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激 发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测 定。发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得 以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或 半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明锰离子浓度测定方法原理如下草酰乙酸草酰乙酸脱羧酶/Mr^丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+乙酰辅酶厶+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶八+辅酶 这种方法应用需要锰离子激活的草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetate decarboxylase ; EC 4丄1.3)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ; EC1.2丄51)酶促反应连续监测法/速率比色法。草酰 乙酸脱羧酶，在锰离子的激活下，酶解草酰乙酸反应产生二氧化碳， 再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测 定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光 度下降的速度，可以测算锰离子的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/ 测定试剂盒较为理想-缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L草酰乙酸 20mmol/L 乙酰辅酶A 20 mmol/L草酰乙酸脱羧酶 10000 U/L丙酮酸脱氢酶 10000 U/L本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括.-缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰 乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶。 还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱 氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶。 还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锰离子浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的锰离子诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸 乙酰辅酶A草酰乙酸脱羧酶 10000 U/L丙酮酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离 子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延 迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。实施例二本实施例的锰离子诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶草酰乙酸乙酰辅酶A10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂草酰乙酸脱羧酶100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L丙酮酸脱氢酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离 子样品与试剂l、试剂,2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。实施例三本实施例的锰离子诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸 乙酰辅酶A50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂丙酮酸脱氢酶 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液500 mmol/L 10000U/L100mmol/L500 mmol/L 10000 U/L稳定剂草酰乙酸脱羧酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定锰离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反 应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波 长405nm，被测锰离子样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右， 检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的锰离子浓度测定方法，其方法原理如下草酰乙酸 草酰乙酸脱羧酶/Mn2+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸+辅酶A+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰离子的浓度大小测定结果。
2.理如下草酰乙酸草酰乙酸脱羧酶/Ml^ 丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶八+辅酶 将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰离子的浓 度大小测定结果。 一种锰离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括20-500 mmol/L1— 4000 mmol/L0.1--0,35 mmol/L-50 mmol/L缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸 乙酰辅酶A草酰乙酸脱羧酶 丙酮酸脱氢酶其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙 酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶组成单剂试剂。iooo-iooo-1-50 mmol/L——80000 U/L ——80000 U/L
4. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙 酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定 齐0、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶组成。还原型辅酶、草酰 乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l或试 剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙 酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定 齐廿、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成；试剂2,由缓冲液、 稳定剂、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂草酰乙酸 脱羧酶组成。还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧 酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol),丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。
文档编号G01N33/84GK101324595SQ20071002320
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司