专利名称：谷氨酸诊断/测定试剂盒及谷氨酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨酸 浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景中华人民共和国国家标准GB5009-2003味精卫生标准分析方法有l.旋 光计法2.甲醛滴定法3.凯氏定氮法。味精系指以粮食及制品为原料经发酵提 纯的谷氨酸钠。酶法分析是国际上公认的谷氨酸盐的分析方法，已被多个国际权威组织 或机构采纳如IFU (国际果汁生产者协会)，AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产 者联盟)，及MEBAK,OICC,VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测 方法。已被写入澳大利亚，荷兰，德国，瑞士等多个国家的食品法。国内也 有数家果汁、酒类加工企业使用酶法试剂盒作为检测标准。生物体内存在分解骨质的破骨细胞和形成骨骼的成骨细胞，正常情况下 两种细胞的作用保持着良好的平衡。如果平衡被打破、破骨细胞过于活跃， 就会导致骨质疏松。破骨细胞中含有谷氨酸，而一种名为"谷氨酸转运体"的 蛋白可以将谷氨酸排出破骨细胞，被"释放"的谷氨酸会和细胞表面的受体结 合，激活细胞内的酶，抑制破骨细胞分解骨质的作用。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致 在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定谷氨酸浓度的方法，同时， 本发明还将给出用以实现该方法的谷氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅 可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行谷氨酸浓度测定，而且 测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明谷氨酸浓度测定方法原理如下 L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+ 2-酮戊二酸酯+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶n引嗒胺色原或醌亚胺色原+水这个方法应用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶联过氧化物酶(peroxidase ; EC Ul丄7)酶促反应终点/速率比色法。谷 氨酸氧化酶酶解谷氨酸反应，再通过偶联过氧化物酶的作用，最后生成的过 氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染 料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组 合的不同而定)波长处，测定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺 色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小；通过测量400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度/速度，得出谷氨 酸浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明谷氨酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L过氧化物酶 30000 U/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L还原型色原体组合0.1-20 mmol/L所述还原型色原体组合,(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1^-乙基一^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙任溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮脂尔双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒1^-乙基^>4- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4_羥基_3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的谷氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接 使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、谷氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。试剂3缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、谷氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L过氧化物酶 30000 U/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，测试主波 长505nm，测试副波长600nm，被测谷氨酸样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nrn吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。实施例二本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括-试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸0.2 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L过氧化物酶谷氨酸氧化〖4-氨基抗砒30000 U/L 10000U/L 0.6 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测谷氨酸样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。 实施例三本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂3-甲基-2-苯噻唑酮腙50 mmol/L0.6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸—盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L试剂3双甲基苯胺三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂过氧化物酶谷氨酸氧化酶2 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L30000 U/L10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C,反应时间IO分钟，测试主波长 578nm，测试副波长660nm，被测谷氨酸样品与试剂的体积比例为1/30，反 应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约0分 钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析13仪下，检测主波长578nrn吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原 体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不 另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器 得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法技术的谷氨酸浓度测定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+2-酮戊二酸酯+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出谷氨酸浓度大小测定结果。
2. —种谷氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000mmol/L过氧化物酶 500——80000 U/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成 单剂试剂。4. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。 过氧化物酶、还原型色原体组合、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。5. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组 成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂 2，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳 定剂、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组 合、谷氨酸氧化酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。6. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 齊基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻咬胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出谷氨酸浓度的大小。
文档编号G01N21/31GK101324570SQ20071002339
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司