专利名称：半乳糖诊断/测定试剂盒及半乳糖的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半 乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景牛奶在营养界素有"液体黄金"的美称，我国早在1992年由七部位联合提出"一杯牛奶强壮一个民族"的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用 分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑 的迅速成长有密切关系。牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人 体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素 的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是 造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86.7%，不耐受指数为0.9。为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己 是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外 最常用的一种方法，更为简便、经济、可靠。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连 续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定半乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的半 乳糖诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行半乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本发明半乳糖浓度测定方法原理如下半乳糖+氧 半乳糖氧化酶 半乳糖hexodialdose +过氧化氢 过氧化氢+辅酶 NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧 这种方法应用半乳糖氧化酶(galactose oxidase; EC 1.1.3.9)偶联 NAD(P)H氧化酶(NAD (P) H oxidase; EC 1.6.3.1)酶促反应速率比色 法/终点法。半乳糖氧化酶酶解半乳糖反应产生过氧化氢，再通过偶联 NAD(P)H氧化酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成 为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度， 可以测算半乳糖的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明半乳糖诊断/测定试 剂盒较为理想 ' 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L半乳糖氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L本发明的半乳糖诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓沖液、稳定剂、辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂l缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可 以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、半乳糖氧化酶。 辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定半乳糖浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L半乳糖氧化酶 10000 U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间10分钟，起始吸 光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约 0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖 的浓度大小。实施例二本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂半乳糖氧化酶100 mmol/L500 mmol/L画00U/LNAD(P)H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1,测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。实施例三本实施例的半乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L稳定剂 辅酶 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂NAD(P)H氧化酶试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂半乳糖氧化酶50 mmol/L 3 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L100讓ol/L 500 mmol/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定半乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测半乳糖样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟 左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的半乳糖的浓度测定方法，其方法原理如下半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖hexodialdose+过氧化氢过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出半乳糖的浓度大小测定结果。
2. —种半乳糖诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-稳定剂 l一—500 mmol/L-4000 mmol/L6 mmol/L半乳糖氧化酶 NAD(P)H氧化酶1000--80000 U/L1000-■00 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成单剂 试剂。
4. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成双剂 试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成。辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成多剂 试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、半乳糖氧 化酶组成。辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1 、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定半乳糖浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出半乳糖的浓度大小。
文档编号G01N33/66GK101324582SQ20071002338
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司