专利名称：：一种用于检测肝纤维化的液相芯片及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药生物类，具体地是涉及一种用于检测肝纤维化的液相芯片及其制备方法。
背景技术：
：肝纤维化是指在各种慢性肝病中，肝细胞发生持续、反复的坏死或炎症剌激，导致机体发生修复反应，大量纤维增生同时伴有纤维降解相对或绝对不足，细胞外基质在肝内大量沉积的病理过程。肝纤维化不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病的共同病理过程，同时也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重要原因。中国是病毒性肝炎的高发国家，各种慢性肝病的主要病理发展是通过肝纤维化再恶化为肝硬化，且多见于壮年，慢性肝病经由肝纤维化发展到肝硬化，乃至发生门脉高压、腹水、肝性脑病甚至肝癌等严重并发症。大量临床研究表明，因为体内存在纤维降解过程，肝纤维化是可以减轻和逆转的，但发展至肝硬化则再不可逆。如能阻断、减轻乃至逆转肝纤维化，就能在很大程度上改善肝病的预后。因此，早期诊断肝纤维化，阻止或延缓肝纤维化发生、发展，对于肝病的诊治具有重要的价值。目前诊断肝脏纤维化的方法可分为三大部分-①病理学诊断到目前为止，经肝穿或经腹腔镜肝活检，进行组织病理学检査仍是诊断肝纤维化和肝硬化的"金标准"。但肝活检本身也存在许多问题，如肝脏病变的不均匀性而导致的取样误差，以及由于存在一定的创伤性，患者难以接受，很难反复取材等，因此不能动态地观察肝纤维化及纤维化形成的情况。此外，肝穿针的质量、肝穿的深度、肝穿组织的量，切片、染色等过程均可影响组织病理诊断的准确性。②影像学诊断对纤维化的特异性识别是影像学研究的一个重要问题，但X线和B超不能对纤维化作出确诊和鉴别诊断。③血清学诊断血清学诊断是研究最广泛的肝纤维化诊断方法。该法取材方便，价格低廉，并可早期诊断，已成为目前应用最为广泛的方法。近年来，临床上将肝纤维化时释放于外周血中的某些代谢产物浓度作为反应肝纤维化的非侵入性检测指标。血清肝纤维化标志物主要有III型前胶原(PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)，层粘连蛋白(LN)，透明质酸酶(HA)，脯肽酶(PLD)。动物实验显示，血清HA、PIIIP、LN和IVC依据肝脏病理分级和分期的增加而升高，正常人与肝纤维化患者血清HA、PIIIP、LN和IVC有显著性差异(PO.Ol)，且随着疾病的严重程度而升高(PO.Ol)。然而，血清肝纤维化指标由于受到多方面结缔组织代谢的影响，单项指标只能反映肝纤维化的某个方面，对诊断肝纤维化的准确性不高。联合检测有助于肝纤维化的诊断(王晋云，2001;钱引坤，2001;赵明，2003;张雪松，2004;林城，2005;肖兰，2006;王霞，2006;张斌，2006;韩建国，2006等)。临床达成共识的常用组合为PIIIP+IV-C+HA+LN，称为肝纤维化四项检査。其中，透明质酸酶(HA)是肝细胞外间质中的蛋白多糖，主要由肝内间质细胞合成，内皮细胞参与降解。肝纤维化时HA合成增加，降解减少，血清水平升高。多项研究结果显示，血中HA在肝纤维化早期即见显著增加。HA是目前众多纤维化生化指标中最为敏感和特异的指标，其诊断的准确性为82.19%，特异性为93%，敏感性为56%。IV型胶原(IV-C)主要存在于Disse腔及汇管小血管周围，是基底膜的主要成分，在细胞黏附、分化和基因表达中起重要作用。肝纤维化时IV-C沉积增加，是反映肝基底膜胶原变化的可靠指标。m型前胶原(Piiip)是ni型前胶原裂解下来的N末端肽，肝纤维化早期pnip合成活跃，晚期合成减慢。层粘连蛋白(LN)是细胞外基质糖蛋白成分，是细胞外骨架的支撑结构，并对细胞外基质其他成分有黏附作用。血清LN值反映了基底膜的更新率，可反映肝窦的毛细血管化和汇管区纤维化的范围。血清LN对判断肝纤维化的特异性和正确率分别为98%和92%，但其敏感性只有63%。而联合检测则可使检测的灵敏度，特异性和准确率等大大提高。钱梅艳等发现联合检测PIIIP，IV-C，HA与LN肝纤维化的阳性检出率高达92X，而各个指标的单独检测则阳性率低于85%。首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心陈煜博士的一项临床试验发现B超联合血清肝纤维四项指标检测，诊断肝硬化的灵敏度为94.4%,特异度为95.5%，准确度达95.1%。肝纤维化四项检査主要使用放射免疫，酶联免疫吸附等方法。然而这些方法每次测试只能获得一个标志物的浓度。如果要检测多个指标，则需要多个反应来完成，不仅浪费时间，同时还浪费标本，检测成本相对较高。因此，应用一次反应同时检测多个指标的技术平台检测肝纤维化具有重要意义。
发明内容针对现有肝纤维化检査方法一次只能检测一个标志物的技术的不便和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种可以四项标志物联检的肝纤维化检测液相芯片，该液相芯片为肝纤维化的早期诊断提供一种无创伤的，准确方便的临床检测手段。解决上述技术问题的技术方案如下一种用于肝纤维化检测液相芯片，主要包括有4-plex包被微球m型前胶原(PIIIP)的捕获抗体(C.Ab-PIIIP)包被的微球，IV型胶原及其片段(IV-C)的捕获抗体(C.Ab-IV-C)包被的微球，层粘连蛋白(LN)的捕获抗体(C.Ab-LN)包被的微球，透明质酸酶(HA)的捕获抗体(C.Ab-HA)包被的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；4-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的III型前胶原(PIIIP)的检测抗体(D.Ab-PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)的检测抗体(D.Ab-IV-C)，层粘连蛋白(LN)的检测抗体(D.Ab-LN)，透明质酸酶(HA)的检测抗体(D.Ab-HA);链亲和素藻红蛋白(SA-PE)。本发明的另一需要解决的技术问题是提供一种上述用于肝纤维化检测的液相芯片的制备方法。一种制备用于肝纤维化检测的液相芯片的方法，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被微球-将50pL微球活化后，28000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280pL50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于28000g，离心l-2min;重复该歩骤；-吸弃上清，将微球重悬于lOOpL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2吗抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550^L;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以^8000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500nLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;-室温避光振荡30min;再于^8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球S8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-1000nLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合；(2)每种检测抗体的生物素标记--依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为訓rpm陽訓Orpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，S8000g离心1—2min;-吸弃上清，加入80nL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力口入10^L50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。本发明综合液相芯片技术平台多指标并行检测的优势与双抗夹心法的灵敏性，进行血清中III型前胶原(PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)，层粘连蛋白(LN)，透明质酸酶(HA)的浓度检测。液相芯片技术也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，微球用聚苯乙烯材料制成，直径5.6um，表面有活性羧基可供化学偶连用，抗原、抗体等生物大分子可通过氨基与微球表面的羧基通过化学反应共价结合(即包被过程)。在微球制造过程中加入红外和远红外两种荧光染料，根据两种染料混合比例的不同将微球进行编码，可区分出上百种不同编码的微球。使用时，先将III型前胶原(PIIIP)的捕获抗体(C.Ab-PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)的捕获抗体(C.Ab-IV-C)，层粘连蛋白(LN)的捕获抗体(C.Ab-LN)，透明质酸酶(HA)的捕获抗体(C.Ab-HA)分别包被于不同颜色编码的微球上，同时分别用生物素标记III型前胶原(PIIIP)的检测抗体(D.Ab-PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)的检测抗体(D.Ab-IV-C)，层粘连蛋白(LN)的检测抗体(D.Ab-LN)，透明质酸酶(HA)的检测抗体(D.Ab-HA)。将包被好的四种微球混合，悬浮于液相，再加入标本，在悬液中微球上标记的C.Ab与标本中相应的检测物的某一个表位异性地结合，之后加入生物素标记的检测抗体与标本中相应检测物的另一表位特异性结合，反应完全后加入荧光物质-藻红蛋白标记的链亲和素，由于链亲和素藻红蛋白(SA-PE)可以与生物素高度特异性结合，因此反应体系中最后形成"微球-C.Ab-PIIIP+PIIIP+D.Ab-PIIIP+SA-PE","微球-C.Ab-IV-C+IV-C+D.Ab-IV-C+SA-PE","微球-C.Ab-LN+LN+D.Ab-LN+SA-PE","微球-C.Ab-HA+HA+0.八1>1^+8八-『四种复合物，以微球为载体，通过Luminex系列液相芯片分析仪器检测，读取微球的色彩编号及SA-PE的荧光值。微球色彩编号可辨别检测项目，SA-PE荧光值与各检测物浓度呈正相关，通过测定III型前胶原(PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C),层粘连蛋白(LN),透明质酸酶(HA)标准品在不同浓度下的荧光值，可以获得各个检测指标标准品浓度-荧光值标准曲线以及标准曲线方程。将待测血清样本检测所得荧光值代入标准曲线方程即可分别求得待测血清样本中的III型前胶原(PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)，层粘连蛋白(LN)，透明质酸酶(HA)的量。本发明所公开的肝纤维化检测液相芯片只需25pL的血清样本即可一次反应同时完成肝纤维化的四种血清标志物的定量检测。同时，与放射免疫，化学发光检测及酶联免疫吸附等方法相比，液相芯片平台检测范围更宽，灵敏度更高，重复性更好。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。因此，本发明利用液相芯片平台进行肝纤维化四项检测，能达到准确快速诊断肝纤维化的目的，具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。另外，本发明的技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量试验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。具体实施方式实施例l:本实施例中，所述各种溶液的配方如下1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(一)用于肝纤维化检测的液相芯片1)包括有4-plex包被微球III型前胶原(PIIIP)的捕获抗体(C.Ab-PIIIP)包被的20号微球，IV型胶原及其片段(IV-C)的捕获抗体(C.Ab-IV-C)包被的36号微球，层粘连蛋白(LN)的捕获抗体(C.Ab-LN)包被的53号微球，透明质酸酶(HA)的捕获抗体(C.Ab-HA)包被的微球56号，上述微球分别具有不同颜色编码；2)4-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的III型前胶原(PIIIP)的检测抗体(D.Ab-PIIIP)，IV型胶原及其片段(IV-C)的检测抗体(D.Ab-IV-C)，层粘连蛋白(LN)的检测抗体(D.Ab-LN)，透明质酸酶(HA)的检测抗体(D.Ab-HA);3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE);还按照现有技术常规配套设有4)分析缓冲液；5)4-plex标准品；6)质控液I;7)质控液II;8)血清基质液；9)封口膜；10)滤板。(二)制备上述用于肝纤维化检测的液相芯片的方法，其步骤包括如下(1)捕获抗体与微球偶联(微球包被)1.分别选取各色微球(Luminex公司)，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20S;2.分别取上述各号微球50pL，分别转移到1.5ml的离心管中，8,000g以上速度离心l-2min;3.去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，8000g速度离心1一2min;4.吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s:5.加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；6.力口入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；7.室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀；8.活化后的微球，^8000g，离心l-2min;9.吸弃上清，将微球重悬于250pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;10.将微球于^8000g，离心l-2min;11.重复步骤9和10;12.吸弃上清，将微球重悬于lOOpL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;13.往悬浮的微球中分别加入相应的l吗抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至50(^L;14.用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡2hr;15.偶联抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;16.吸弃上清，将所述微球重悬于50(HiLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20S;17.室温避光振荡30min;18.所述微球^8000g,离心l-2min;19.吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;20.微球^8000g，离心2min;21.重复步骤18和19一次；22.吸弃上清，将偶眹好好的微球重悬于600pLPBS-TBN溶液中；其它的抗体偶联微球的制备如上述方法，即得PIIIP捕获抗体与20号微球的偶联体，IV-C与36号微球的偶联体，LN与53号微球的偶联体，HA与56号微球的偶联体。23.包被好的微球通过luminex仪器计数；24.包被好的微球置于2-8'C避光保存。一般每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。(2)每种检测抗体的生物素标记-考马斯亮蓝法测定蛋白浓度；-依据蛋白浓度计算反应体系，填写表格；-依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积(V):-配置NHS-Biotin反应液；-按摩尔比1:100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液;-加入1/10目标体积的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25。C恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin-测定蛋白浓度；-加入0.02%NaN3于已结合有生物素的抗体溶液中。-在4'C避光保存。使用时，依据检测项目选择混合。(三)利用本发明所述肝纤维化四项平行检测液相芯片进行检测1.使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。2.标准品的稀释分别根据四种血清标志物的血清学浓度的范围，配制4种肝纤维化血清标志物的标准品，每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.样品处理所有样品须用分析缓冲液作l:5稀释后才可用于测定。4.设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。5.按照设置好的96孔板布局，每孔加25nl分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品、待测样品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。6.分别取出上述制备的针对肝纤维化四项血清标志物的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，再用超声清洗仪处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为40个/pl。往每孔中加入四种微球混合的悬液25^1。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。7.用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。8.孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述四种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。9.孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。10.于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。(四)实验结果如下(请参见图1至图4)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实验结果显示，PinP，IV-C，HA,LN各指标标准曲线的线性在检测的浓度范围内R2》0.99，实测浓度与预期浓度的相对误差不超过5%。通过四项指标的联合检测，预计可使肝纤维化诊断的灵敏度达到85%以上，特异性达到92%以上，准确率达到90%，阳性检出率达92%。图1是检测PIIIP的标准曲线示意图;图2是检测IV-C的标准曲线示意图;图3是检测HA的标准曲线示意图；图4是检测LN的标准曲线示意图。权利要求1.一种用于肝纤维化检测液相芯片，其特征是，主要包括有4-plex包被微球III型前胶原的捕获抗体包被的微球，IV型胶原及其片段的捕获抗体包被的微球，层粘连蛋白的捕获抗体包被的微球，和透明质酸酶的捕获抗体包被的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；4-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的III型前胶原的检测抗体，IV型胶原及其片段的检测抗体，层粘连蛋白的检测抗体，和透明质酸酶的检测抗体；以及链亲和素藻红蛋白。2.—种制备如权利要求1所述的用于肝纤维化检测的液相芯片的方法，其特征是，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被微球-将5(HiL微球活化后，28000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280^L50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，再将微球于28000g，离心l-2min;重复该步骤；-吸弃上清，将微球重悬于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2吗抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550(iL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500nLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;-室温避光振荡30min;再于^8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球28000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-1OOOpLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8X:避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合；(2)每种检测抗体的生物素标记-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25。C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为訓rpm-腦Orpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于10(HiL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，S8000g离心l一2min;-吸弃上清，加入pH6.2的80pL的磷酸盐缓冲液，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20S;-加入10nL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-力口入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。全文摘要本发明公开了一种用于肝纤维化检测的液相芯片，主要包括有(1)4-plex包被微球含有分别包被了III型前胶原(PIIIP)捕获抗体、IV型胶原及其片段(IV-C)捕获抗体、层粘连蛋白(LN)捕获抗体及透明质酸酶(HA)捕获抗体的不同颜色编码微球；(2)4-plex生物素标记检测抗体分别用生物素标记的PIIIP、IV-C、LN、HA的检测抗体；以及(3)链亲和素藻红蛋白。本发明还公开了该液相芯片的制备方法。本发明所述的用于肝纤维化检测液相芯片具有无副作用，高通量，多指标并行检测；敏感度高，重复性好，检测快速，准确，费用低等优点。文档编号G01N33/544GK101178403SQ200710031660公开日2008年5月14日申请日期2007年11月26日优先权日2007年11月26日发明者杨惠夷,林一群,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司