一种快速测定青霉素酰化酶酶活的方法

专利名称：：一种快速测定青霉素酰化酶酶活的方法
技术领域：
：本发明涉及酶活的检测方法。
背景技术：
：为了解决病菌对青霉素等抗生素抗药性的提高，人们发明了人工半合成青霉素等人工抗生素。自从青霉素酰化酶法水解制取6-APA和7-ADCA取代传统的化学裂解工艺以来，青霉素酰化酶法成为了目前半合成-内酰胺类抗生素工业中如头孢霉素和羟氨苄青霉素的主要生产方法，青霉素酰化酶也从此登上了重要的工业舞台。至今国内工厂在裂解生产中使用的固定化青霉素酰化酶还有一半是进口商品，所以国内研究生产提供青霉素酰化酶是十分重要的。目前世界上用于工业生产的固定化青霉素G酰化酶主要来自大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的发酵生产。对它的酶活测定的方法也在不断地摸索改进中。下面就介绍一下一般青霉素酰化酶的测定方法。最初，人们以原料青霉素作为底物，酶解得到产物脱苯乙酰生成6-氨基青霉垸酸(6-APA)，测定单位时间单位体积6-APA的生成量来得到酶活。为了检测到6-APA，人们发展了不同的方法如PDAB法等。但马上都发现了底物青霉素对各种检测产物6-APA的方法都有不可忽略的干扰，测量前必须抽提掉青霉素。这样这种酶活测定的方法不仅步骤繁琐，而且灵敏度很低。90年代，有人发展了荧光检测法，用荧光胺结合6-APA。此方法可以极大地降低底物青霉素干扰，并同时因为用荧光检测使灵敏度提高104倍。可是多肽类物质和荧光胺结合影响严重，需调节PH至4才能消除影响。这样使酶活测定环境大大改变，令它的准确性和可靠性降低。事实上在青霉素法使用不久后人们便找到了一种替代青霉素的底物6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)，产物为6-硝基-3-氨基苯甲酸。这种方法不仅解决的底物干扰的问题，而且产物本身是可检测的淡黄色物质，可在波长405nm下用分光光度计检测浓度。如此，简化了测量步骤，并使灵敏度较PDAB法上升了三个数量级以上(约5000倍)。这种方法就是至今仍为主要运用的NIPAB法。NIPAB底物较昂贵，并且它的酶活反应不是以青霉素本身为底物，所以很多研究特别是生产上考虑到节约成本等仍使用青霉素法。要申请的本专利就是基于NIPAB的发展。以下是传统的NIPAB法，步骤较繁琐发酵液离心去上清保留沉淀，沉淀细胞用磷酸缓冲液重悬后采用超声波、高压或冻融等细胞破碎法破碎细胞，离心取上清。取上述上清液20u1加入980u150mmol/LpH7.5的磷酸缓冲液中，37。C保温。再加入lml已在37。C下预热的0.9mg/mlNIPAB溶液，精确反应4min，加入ltrtl乙醇终止反应。取上述已终止的反应液在分光光度计波长405mn下检测吸光值。酶活力定义在上述反应条件下，1min水解1ymol的NIPAB所需青霉素酰化酶为1个酶活力单位U。酶的菌体比活力定义为每升每ODe。。菌体所具有的酶活力单位。酶活力计算公式106XA405XV0酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(1)其中t:反应时间(min)p:标准曲线的斜率V:反映体系总体积(ml)样品光密度读数于空白样品光密度读数差VI:酶液体积(ml)比色皿厚度默认为1,单位为cm上述方法步骤繁琐，给操作带来极大不便。通常实验室中为了快速测定少量样品会不破细胞直接测酶活，但试验数据表明无论有毒性的三氯乙酸还是乙醇都难以彻底终止反应。
发明内容本发明的主要目的就是为微生物发酵生产的青霉素酰化酶提供简便快捷的酶活测定方法。本发明针对原来的NIPAB方法步骤繁琐的问题，从即可简化步骤，又不影响检测效果的角度出发，提供了一种新的快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步骤-a)取青霉素酰化酶基因工程菌发酵液用pH7.4—7.8的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液稀释10-50倍；h)用pH7.4—7.8的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液配制NIPAB溶液；c)取步骤a获得的稀释液与步骤b获得的NIPAB溶液先后加入酶标板，控制反应体系中NIPAB的量为过量；d)在37°C，用酶标仪振动混匀下，在405nm处动态曲线方式连续检测吸光度4一5分钟，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标获得动态反应曲线；e)动态曲线减去空白板与空白样后线性回归得斜率k与截距b。f)计算酶活酶活力(U/L)=_，其中酶活力单位为U/L。pXV,其中p:标准曲线的斜率V。反映体系总体积，单位为mlV1:酶液体积，单位为ml上述酶活力计算公式由酶活力基本计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)变换而来，其中，A4。5/t就是单位时间内吸光值的变化，即酶标仪数据处理得到的k。上述步骤a中，取青霉素酰化酶基因工程菌发酵液用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液稀释时，高密度罐发酵一般稀释50倍，摇瓶发酵按生长密度一般为10-50倍；优选的，上述步骤a和b中所述缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液。优选的，上述步骤d用酶标仪连续检测中，相邻两次检测的时间间隔为0.5分钟。上述步骤c中需控制反应体系中NIPAB的量为过量的原因是酶量一定时，酶反应随着底物浓度不断增加到一定程度将表现为0级反应，即酶反应速率不再受底物浓度的影响。因此在底物远远过量的情况下，酶反应速率对酶浓度呈线性关系。一般而言，以反应液的总体积为基础计，当发酵酶液被稀释约50倍时，NIPAB的浓度在0.65mg/inl以上即可保证达到整个反应过程中为过量，0.9mg/ml大约为室温下去离子水作溶剂的饱和浓度。根据本发明公开的内容并结合现有技术，所属
技术领域：
的人员可以灵活地控制酶液的稀释倍数、NIPAB溶液的浓度以及两者混合的比例，从而达到确保NIPAB过量的目的。当然，为了方便控制，可如优选的实施例那样，步骤b中，配制NIPAB溶液的浓度为0.9mg/ml;步骤c中，将步骤a获得的稀释液与步骤b获得的NIPAB溶液以等体积的量先后加入酶标板。此外，本发明还进行了温度对酶活检测数值影响的研究，给出了室温检测时的校正系数，以使检测更为方便。其中，当上述步骤d为在室温下，用酶标仪进行检测时，步骤f计算酶活酶活的公式就调整为106XkXV0X1.2酶活力二pXVj其中酶活力单位为U/Lp:标准曲线的斜率V。反映体系总体积，单位为mlVl:酶液体积，单位为ml。由于本发明最大的特点在于不终止酶反应，而是测定一个动态反应曲线，因此命名为动态法测青霉素酰化酶酶活。本发明从即简化操作步骤又保证准确性的角度出发来考虑新的青霉素酰化酶酶活检测方法，具体思路及原理如下省去最为繁琐的破碎细胞步骤，这是因为NIPAB可以出入酶所在的周质空间，细胞不破碎也不会影响NIPAB与酶的反应。特别对于不久前出现的直接固定化周质空间中含有青霉素酰化酶的细胞来生产半合成抗生素的技术来说，有重要的意义。此外，由于在实际检测过程中样品往往需要冰箱保存，冻融对细胞破损严重，简单的离心提取对测得的酶活损失影响很大，因此也考虑省去了离心等不必要的操作步骤。本发明中，动态法是解决简化步骤后保证(甚至提高)测量准确性的关键。采用动态法来测定酶活是由于经研究发现，如不破碎细胞而仍采用终止法，由于乙醇对进出细胞终止反应的效果很不理想，特别是在高密度大规模培养条件下的发酵液，4min精确计时的反应时间就根本无法保证。并且试验发现培养基成分、细胞组织碎片等对吸光度数值影响极大，终点法下任何样品液预处理步骤的省略都将对酶活值得测量带来不可忽率的偏差。而采用"动态法"后，就可以省略终点法中大部分不必要的纯化预处理过程，不仅使杂质影响消失，还提高了酶活测量值的可靠性。采用动态法测酶活省略了样品处理过程，对测量过程却更复杂了。而酶标仪的功能对解决青霉素酰化酶活测量上遇到的问题十分适合。因此本发明中进一步采用动态法结合酶标仪从而实现了简化检测步骤，提高检测准确度的目的。研究发现，使用酶标仪试验在原本终点法的4一5分钟内，酶活曲线线性关系良好，可用线性回归计算得曲线斜率值，从而计算获得酶活。改进后方案比传统的NIPAB法更适用于高密度发酵生产的使用酶标仪动态曲线法测青霉素酰化酶酶活下表为本发明与以往检测青霉素酰化酶酶活方法的总结和比较:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>总体来说，本发明的方法步骤简单，准确度高，节约成本，且适合检测高密度发酵生产的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推广价值。图h实施例2的动态曲线图图2:实施例6动态法测温度对酶活的影响图图3:实施例6终点法测温度对酶活的影响图具体实施例方式实施例l标准曲线的绘制和斜率p值的确定。NIPAB法在波长405nm下检测的是它的酶解产物緒BA(5-氨基_6-硝基苯甲酸)的吸光值，因此先绘制标样ANBA的标准曲线。标准曲线是以ANBA的浓度(mol/L)为横坐标，A.,05为纵坐标的曲线，为线性，可得出它的斜率P。实验步骤-a)取ANBA标准品用50mmol/LPH7.5磷酸钾盐缓冲液分别稀释到10mmol/L、20mmol/L、40,1/L、50,1/L、60,1/L和80腦1/L。b)以上每种浓度分别置适量于一试管中，共有1——6号试管空白管为0号，为50mmol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液。c)上述0——6号管置于37。C恒温。然后用721分光光度计或酶标仪在405nm波长下检测吸光值，记录。d)以ANBA浓度(mol/L)为横坐标，吸光值为纵坐标作图，并线性回归求得相关数据。实验结果获得P值为8976。实施例2构建大肠杆菌青霉素酰化酶基因工程菌DH5a/pKKFPGA(构建方法由《粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化》，《生物工程学报》20巻第5期，736~740公开)，其宿主菌是DH5a(supE44，△lacU169(*80lacZ△M15)，hsdR17，recAl，endAl'gyrA96，thi-1,reAl)。质粒pKKCAII，Pkk235衍生质粒，不含laciq等位基因，表达为组成型。采用不同条件高密度培养上述大肠杆菌青霉素酰化酶基因工程菌进行对照。重组大肠杆菌霉素酰化酶基因工程菌的发酵周期为48h，发酵温度28'C，500ml摇瓶发酵220rpm。不同条件分别为发酵培养基中含有0.5mMCu"、含有0.5m顧i+以及不含有这两种离子的三种条件。分别用不破碎细胞并不离心操作下的终态酶活测量方法和用酶标仪动态曲线测量法测酶活比较。(注数据值只用注意纵向比较，即不同方法间的差异，u即为U/L)1.不破碎细胞并不离心操作下的终态酶活测量方法测酶活试验步骤a)取不同条件下青霉素酰化酶发酵液9个样品，编号为1一9号；b)1—9号样品分别用50mmol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液稀释50倍；c)取上述步骤获得的9个混合液各lml以及作空白管的pH7.5磷酸钾盐缓冲液lml分别置于10个10ml试管中放在37。C水浴锅中恒温；d)把足量(15m1-20ml)用50腿ol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液配制好的0.9mg/mlNIPAB溶液同样置于37t水浴锅中预热；e)准备好后开始计时，快速依次在1—9号试管以及空白管里各加入lml步骤d)处理的NIPAB溶液；f)精确计时到4分钟时，快速依次在1—9号试管及空白管里各加入lml90X(质量百分比)乙醇来终止反应；g)终止后立刻用721分光光度计在405nm下依次测得1—9号及空白管的吸光值，样品管减去空白管值即为公式(1)中所需A405，计算得酶活。得到最终酶活数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.酶标仪动态曲线测量法测酶活实验设备ThermoLabsystems公司的MultiskanMK3型酶标仪实验步骤-a)按使用说明对酶标仪进行参数设置，设置孵育时间为1分钟，孵育温度37'C。孵育后设为振荡步骤，采用动态检测，检测时间间隔设为0.5分钟，连续检测4分钟；b)取1—9号发酵液用50rmnol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液稀释50倍；c)取步骤a获得的混合液与作空白管的pH7.5磷酸钾盐缓冲液各lOOu1预热至37。C后依次加入96孔酶标板；d)在加样的IO个孔内快速加入已经在37t:预热的用50mmol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液配制的0.9mg/mlNIPAB各100y1;e)后把96孔板放入仪器，开始反应并自动测量，结束后获得以时间为横坐标，吸光值为纵坐标的动态反应曲线；f)动态曲线减去空白板扫描值后线性回归得斜率k与截距b，用公式(1)计算得酶活值。表1是酶标仪测得原始数据表,动态曲线参见图1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>图1以"1组"为例，线性回归得到公式显示于上方。表2是用公式(1)计算最终得到的酶活数据表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.不破碎细胞并不离心操作下的终态酶活测量方法和用酶标仪动态曲线测量法测酶活比较动态法总酶活总低于不破碎细胞并不离心操作下的终点法，这主要由于终点法中，乙醇在规定4min内无法彻底终止反应以及非酶反应对吸光度的影响造成。截距酶活定义为反应时间为O时的酶活值，不随时间变化而变化。之所以在反应时间为0时也会出现酶活是由于非酶反应因素影响吸光值，从而在代入用吸光值推算酶活的公式后会获得对应的酶活值。从实验中可以发现，样品不做预处理特别是酶活低时非酶反应因素对产物所在波长的吸光值影响巨大，他们不随时间变化而变化。本方法中，截距酶活的存在并不会影响酶活值的准确性。实施例3利用动态法测青霉素酰化酶酶活来研究测量中对吸光值产生影响的因素首先对所有会对吸光值产生影响的因素对应的酶活值进行设定可溶性培养基中胞外的酶其为某种机制少量分泌到胞外的酶，还有细胞冻融等原因破碎，到培养基中的酶，其酶活设为ul;可溶性培养基其酶活设为ua。去上清物质胞内酶其酶活设为U2;菌体及不可溶培养基其酶活设为ub。按上述描述，在动态法测量中，酶活u的数值为ul+u2，截距酶活的数值为ua+ub同实施例2中的样品1—9号，各取10ml，离心机3000rpml0分钟后去除上清液，小心洗涤后用pH7.5磷酸钾盐缓冲液重悬，如是三次。再用实施例2中动态法的操作步骤用酶标仪进行测量，结果如表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上表中胞内酶活即u2，去上清截距酶活即为ub。这样结合表2，计算可得:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述试验结果表明，酶大部分在周至空间中，会有一些由于冻融破壁等原因到胞外。菌体等不溶物质对波长405nm浅黄色的吸光值影响最大，培养基等的影响也很大，它们在低酶活时(如摇瓶短时培养及组成型培养等情况)比酶反应产物对吸光的贡献更大。实施例4不离心去除杂质及不破碎细胞的简略终点法中乙醇终止效果的研究以下实验是对于不离心去除杂质及不破碎细胞的简略终点法中乙醇终止效果的研究。同一个样品在不同乙醇浓度的终止下终止效果随时间的变化。实验步骤基本同实例2，变化处与结果于表5列出表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果显示不同浓度的乙醇的终止效果有差别，且随时间波动较明显。开始时由于不能终止反应酶活上升，终止时间过长后由于温度等环境因素显著变化以及产物分解等原因酶活有所下降。可以看出乙醇终止效果不良会带来显著误差，且大批量样品测量时手动终止反应将很难精确控制时间。但比较实例3可以发现乙醇终止效果不良相对于杂质影响程度要小许多，因此传统终态法在离心去除杂质的少量样品测量中可以将误差降到很低。实施例5传统方法与新动态法的比较本实例为传统方法与新动态法的比较，结果显示新法在省略大部分繁琐的样品处理过程后仍保持着很高的精确度，完全克服了杂质干扰。某一批培养的发酵液样品分别采用如下传统和动态法两种不同的处理、测量方法进行测量。传统法中的破碎细胞本实例中使用两种方法冻融法结合溶菌酶处理，超声波破碎。传统法步骤a)取发酵液10ml离心6000rpm15min，去上清保留沉淀；b)沉淀细胞用50mmol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液重悬后采用超声波、冻融等细胞破碎法破碎细胞，离心6000rpm15min取上清；c)取上述上清液20u1加入980y150mmol/LpH7.5的磷酸钾盐缓冲液中，37°C保温。再加入lml已在37。C下预热的0.9mg/mlNIPAB溶液，精确反应4min，加入lml乙醇终止反应；d)空白管用lml50mmol/LpH7.5磷酸钾盐缓冲液代替稀释的发酵液，其他操作相同；e)取上述已终止的反应液在分光光度计波长405nm下检测吸光值。按上述步骤得到超声波与冻融法破碎细胞处理的样品的吸光值分别为0.024、0.030，按公式计算的酶活为100u和125u。动态法步骤同实例2。此外，把前述传统法样品处理方法处理的样品也使用酶标仪动态测量计算，结果一并列出，如下表。酶标仪所得动态曲线数据处理同实例2。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>不同于传统方法，本实例把破碎后离心操作所得的上清与沉淀组分都测定了酶活，同列于上表。此表显示的酶活与前传统法现实的酶活吻合:传统法略低于动态法，可能缘于处理过程中的产物损失；破碎可能不够彻底，离心沉淀中仍有少量酶活；超声波破碎酶活稍低，可能是因为特定的操作损失产物如超声波产生的高温；截距酶活显著，特别是不溶物沉淀，与前述实例中的情况相符。本实例验证了新动态法与传统方法的测量结果相符，是可靠的。实施例6温度对酶活检测方法的影响试验由于温控、振动设备等不是酶标仪的必需配件，属于附件，所以很多酶标仪并不具有温控等装置。其中温控对酶反应测酶活非常重要的，酶反应速率受温度显著影响。考虑到这个，用酶标仪在不同的温度下测酶活探究规律。将青霉素酰化酶基因工程菌(同实施例2)发酵培养。5L罐发酵，装液量1L，接种量10%。通气量0.5VVM，培养温度28。C，溶氧保持在30%以上。发酵周期为72h，此为48h取样。取三个平行样编号为a、b、c，分别在21。C、27°C、32°C、37°C、42。C和47。C下测酶活，步骤通实施例2中的动态法的试验步骤。所得数据以温度rc)为横坐标、酶活(U/L)为总坐标作图，如图2可以看出指数型曲线在37'C前接近线性，变化幅度较小，从室温到37'C增长小于并接近20%的酶活值。后又用某一批发酵培养得到的发酵液样品，用终点法使用恒温水浴锅控温，分别在17°C、22°C、27°C、32°C、37°C、42°C、47'C和52"C下721分光光度计测酶活。所得数据用公式(1)算得酶活，同样以温度(°C)为横坐标、酶活(U/L)为总坐标作图，得图3。温度对酶反应速率的影响研究用终态一点法和动态法的得到的结论是相符的，酶的最适温度在45。C左右。而在37。C前保持着近似线性关系，从室温到37^酶活上升20%。据此获得室温检测的酶活与37'C下测得酶活的校正系数酶活(37'C)=1.2x室温酶活。参考上述实验，对于没有温控装置的酶标仪，在实验室于室温下测得的酶活值可以乘上1.2这个校正系数，对于室温以外的温度也可以乘上相应的系数以减小误差。对于15'C及以下的低温和37°C以上高温校正系数不适用乘以校正系数的方法。权利要求1.一种快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步骤a)取青霉素酰化酶基因工程菌发酵液用pH7.4-7.8的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液稀释适当倍数；b)用pH7.4-7.8的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液配制NIPAB溶液；c)取步骤a获得的稀释液与步骤b获得的NIPAB溶液先后加入酶标板，控制反应体系中NIPAB的量为过量；d)在37℃，用酶标仪振动混匀下，在405nm处动态曲线方式连续检测吸光度4-5分钟，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标获得动态反应曲线；e)动态曲线减去空白板与空白样后线性回归得斜率k与截距b；f)计算酶活其中酶活力单位为U/Lp标准曲线的斜率V0反映体系总体积，单位为mlV1酶液体积，单位为ml。2.如权利要求1所述快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步骤a和b中所述缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液。3.如权利要求l所述快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步骤b中所述NIPAB溶液的浓度为0.9mg/ml，步骤c中所述步骤a获得的混合液与步骤b获得的溶液以等体积的量先后加入酶标板。4.如权利要求1所述快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，所述步骤d为在室温下，用酶标仪振动混匀下，在405nm处动态曲线方式连续检测吸光度4一5分钟，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标获得动态反应曲线；所述步骤f中，计算酶活的公式为106XkXV0X1.2酶活力=。<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>5.如权利要求1或2或3所述快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步骤d中，用酶标仪动力学检测时，相邻两次检测的时间间隔为0.5分钟。全文摘要本发明涉及酶活的检测方法，公开了一种快速测定青霉素酰化酶酶活的方法，在不破碎细胞的情况下使用酶标仪采用动态法检测酶活，获得动态反应曲线，用动态曲线线性回归后获得的斜率及截距计算酶活。此外，还对温度对酶活测定的影响作了简单研究，并设置了修正系数方便于室温的快速测定。本发明的方法步骤简单，准确度高，节约成本，且适合检测高密度发酵生产的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推广价值。文档编号G01N33/543GK101201356SQ20071004811公开日2008年6月18日申请日期2007年11月13日优先权日2007年11月13日发明者炬储,庄英萍,张嗣良,施晓疌,王永红,袁中一申请人:华东理工大学