专利名称：：一种同位素标记的抗mhcii单克隆抗体的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用同位素188Re标记的抗MHC-II分子单克隆抗体在体外单向混合淋巴细胞培养模型中的应用。
背景技术：
：通过组织，细胞或者器官的移植，来代替丧失功能的组织，细胞和器官是现代医学治疗的重要手段之一。提供移植物的个体称作供者，而接受移植物的个体称为受者。根据供者和受者的组合，可以有以下三种移植类型自体移植，是指把来自移植受者本身的组织或者器官移植给受者。同种同基因移植，是指遗传结构完全相同或非常相似的个体之间的移植。同种异基因移植，是指同一动物种内遗传结构不同个体之间的移植。异种移植，是指不同动物种的个体之间的移植，如猪人之间的移植。前两种的移植不会发生排斥反应。当前，无论是从国际还是国内的具体实情出发，同种异基因移植(同种异源移植)是临床上主要的也是可行的移植方法。研究表明，在同种异基因移植中，受者对移植物的排斥是移植成功的主要障碍，而发生排斥反应的主要机理也已经得到学界的共识，即是由受者T细胞介导的，针对同种异型抗原的免疫应答。目前，接受器官移植的患者正在逐年增加，但是移植后器官的急性排斥反应的发生率很高，影响了移植的成功率和患者的存活率。现有的抗免疫排斥反应的主要方法仍依赖于各种免疫抑制剂，不仅价格昂贵，而且由于免疫抑制作用，感染，肿瘤的发生机会也明显增加。另外，通过依靠体外培养，冷冻，外部放射疗法，动物过继移植等手段来降低移植物免疫原性从而延长移植器官生存时间的方法取得了一定的效果，但在器官移植中却并无实际的应用价值，例如，外放射疗法使供器官内外接受的发射线往往不均匀，计量过小达不到预期效果，计量过大则可能对供器官造成广泛损害。因此，迄今为止，尚未找到临床使用性强且确切有效的手段。20世纪发现，在不同种属或同种不同系别的个体间进行组织移植时，会出现排斥反应，其本质是细胞表面的同种异型抗原诱导的一种免疫应答。这种代表个体特异性的同种异型抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中能引起强而迅速排斥反应的抗原称主要组织相容性抗原，引起较弱排斥反应的抗原称次要组织相容性抗原。主要组织相容性抗原是一个复杂的抗原系统，编码这一系统的基因位于同一染色体片段上，是一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)。不同种属的动物其MHC有不同的命名，如小鼠的MHC称H-2复合体，猪的MHC称SLA复合体，人的MHC称HLA复合体等。MHC基因包括经典MHC-I和MHC-II基因，分别合成MHC-I和MHC-II类分子抗原，其在分子结构，组合分布和功能上有各自特点。I类分子由重链和卩m链组成，分布于所有有核细胞表面，主要识别和提呈内源性抗原肽，与辅助受体CD8+细胞结合，对CTL细胞的识别起限制作用。n类分子由a链和p链组成，仅表达于淋巴样组织中的各种细胞表面，如专职抗原提呈细胞(包括B细胞，树突状细胞，巨噬细胞等)，胸腺上皮细胞和活化的T细胞等，主要识别和提呈外源性抗原肽，与辅助受体CD4+结合，对Th的识别起限制作用。MHC分子抗原参与T细胞介导的免疫排斥应答途径有两条一是直接识别途径，受者T细胞直接识别移植物上的由供者APC细胞提呈的完整的同种异型MHC分子和肽的复合物，是急性移植排斥反应的主要原因。二间接识别途径，受者T细胞识别由受者APC提呈和加工处理后的从移植物上脱落的供者的同种异型MHC分子肽和受者MHC分子的复合物，与慢性排斥有关。动物实验证实导致急性移植免疫排斥反应发生的抗原一MHC-II类分子主要是来自移植物中的过客白细胞，其中主要是成熟的树突状细胞，成熟的淋巴细胞和单核巨噬细胞，同时在血管内皮细胞表面和部分的T淋巴细胞表面也有表达，实验中在移植前把携带MHC-II的细胞去除，能使MHC-I错配的移植物排斥减慢减轻，甚至不发生，而重新输入携带MHC-II类分子的供者细胞能重建排斥反应，其机制在于携带同种异型MHC-II分子的过客白细胞能激活受者CD4+Th细胞，活化的Th细胞分泌细胞因子，辅助同种异型应答的CD8+CTL细胞充分生长和分化，从而激发排斥反应。如在移植前除去过客白细胞，则同种异型应答的CD8+CTL难以扩增和分化，排斥反应就减弱，因此，应用抗MHC-II单抗可以定向的和靶细胞表面的MHC-II抗原相结合，下调供体的免疫原性，有效降低移植术后发生排斥反应的机会。^Re是"Tc的同族元素，"Tc目前的应用较为普遍，而^Re作为一种新兴的核素，与"Tc相比具有更良好的核物理性质，发射2.12MeV的p"射线，155MeVy射线，半衰期16.9小时，可以迅速从体内排除，不会在体内蓄积。组织中的最大射程为0.97cm，既能有效杀灭与之相结合的过客白细胞，又不会对其他的组织细胞造成大范围的损伤，具有良好的效应和安全性。混合淋巴细胞培养(MLR)是常用的研究T细胞识别外来MHC产物的体外模型，可以用来估计受者体内T细胞介导的移植排斥反应。同种MLR是指来自遗传背景不同的两个个体的单个核细胞(T细胞，B细胞，单核巨噬细胞和树突状细胞)混合培养时出现的反应，如果两者的MHC的等位基因有差别，经过3-7天培养后，其中的T细胞会出现明显的增殖。上述情况下，受试双方的T细胞都可产生增殖反应，称为双向MLR,为方便分析，常常在混合培养前将两种不同来源的有核白细胞的其中一种，进行y射线照射或者丝裂霉素C处理，以抑制细胞的增殖能力而保留起免疫原性，称为单向MLR，经预处理的细胞称为刺激细胞，未处理的细胞称为反应细胞。
发明内容本发明的目的是克服目前各种抑制器官移植后急性排斥反应的方法存在的不足，结合生物学和核医学两种方法，提供一种同位素标记的抗MHCII单克隆抗体的应用，具体是一种188Re-2E9/13F(ab)2在经典的体外细胞免疫排斥模型中有效抑制细胞的免疫排斥反应中的应用通过将188Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓縮，过滤后制备成188Re-2E9/13F(ab)2,构建体外单向混合淋巴细胞反应模型，并将该抗体应用于模型中，检验抗体对细胞免疫排斥抑制作用，具体通过以下步骤实现(1)制备鹏Re-2E9/13F(ab)2:①通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓縮，置于-2(TC冰箱中保存；②从^W，Re发生器中获取^Re04^洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成188Re-2E9/13F(ab)2片段;(2)建构体外单向混合淋巴细胞培养模型①分别设阳性对照组A，为生理盐水处理后的刺激细胞+反应细胞，单抗组B，为单抗处理后的剌激细胞+反应细胞，同位素标记单抗组C，为同位素标记单抗处理后的刺激细胞+反应细胞，阴性对照组D，为反应细胞，每个组又设为48，72，96，120小时不同反应时间，收获细胞后做MTT测试；②分组如①，每组设72和120小时不同反应时间，收获细胞后做RT-PCR，并进行对比分析。本发明的有益之处是改变以往运用单一方法建模的手段，结合生物学和核医学两种方法，在体外由同种异源淋巴细胞所构建的免疫排斥模型中引入了^Re标记的抗MHC-II分子的单克隆抗体2E9/13F(ab)2片段，解决了永久性下调同种异体MHCII类抗原的免疫原性问题，经"8Re-2E9/13F(ab)2片段作用后的刺激细胞对反应细胞的刺激作用与单纯的抗体和生理盐水作用相比有明显的降低。该方法可行性强，较其他延长移植物的生存时间的纯生物性手段而言，具有更强的实用性和有效性，而其在体外由同种异源淋巴细胞所构建的免疫排斥模型中的成功应用，也为下一步动物体内实验和最终应用于临床提供了有力的实践支持和打下了坚实的基础。本专利发明不再运用单一的手段，而是将生物学和核医学两种方法结合起来，率先引入了^Re标记的抗MHC-II分子的单克隆抗体2E9/13F(ab)2片段，，解决了永久性下调同种异体MHC-II类抗原的免疫原性问题，该方法可行性强，较其他延长移植物的生存时间的纯生物性手段而言，具有更强的实用性和有效性，而其在体外由同种异源淋巴细胞所构建的免疫排斥模型中的成功应用，也为下一步动物体内实验和最终应用于临床提供了有力的实践支持和打下了坚实的基础。图1为本发明RT-PCR结果。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一制备188Re-2E9/13F(ab)2:(1)通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓縮，置于-20'C冰箱中保存；(2)从188W-188Re发生器中获取^Re04^洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成188Re-2E9/13F(ab)2片段。实施例二建构体外单向混合淋巴细胞培养(MLR)模型①分别设阳性对照组A(生理盐水处理后的刺激细胞+反应细胞)，单抗组B(单抗处理后的刺激细胞+反应细胞)，同位素标记单抗组C(同位素标记单抗处理后的刺激细胞+反应细胞)和阴性对照组D(反应细胞)，每个组又设为48，72,96,120小时(H)不同反应时间，收获细胞后做MTT测试；②分组如上，每组设72和120小时不同反应时间，收获细胞后做RT-PCR，并进行对比分析。实施例三在体外细胞免疫排斥模型中的应用①外周血分离单个核细胞I.分别取供体和受体猪(不同种系猪)外周静脉血20ml，用生理盐水将外周血按l:l稀释。II-取新无菌离心管，按稀释的外周血和FICOLL的比例为，1.2:l的比例加入FICOLL，在离FICOLL液上面lcm处缓缓的加入外周血。III:离心(2000-2500转/分)25分钟IV:吸取在血浆与FICOLL之间的单个核细胞层到另一个试管，加入PBS液吹打均匀,加入红细胞溶解液,去除多余的红细胞,加入两倍以上体积的生理盐水，离心(1000转/分)IO分钟。加入PBS液清洗淋巴细胞三次.V:弃去上清液，用1640培养液重悬，计数。②供体猪淋巴细胞的处理(1)用丝裂霉素C处理供体猪淋巴细胞，使其失去增殖活性。(2)将处理后的供体猪淋巴细胞设生理盐水组，抗体组及同位素标记抗体组共3个组(即分别用生理盐水，抗体和同位素标记的抗体处理)。每组设三个复孑L。(3)在37度，5n/。CO2的培养箱中孵育30分钟。(4)用PBS洗两次细胞，用lml的1640培养液重悬细胞。③混合淋巴细胞将受体猪淋巴细胞(反应细胞)和处理后的供体猪淋巴细胞(刺激细胞)按1:l混合后种板培养。实验分别设阳性对照组A(生理盐水处理后的刺激细胞+反应细胞)，单抗组B(单抗处理后的刺激细胞+反应细胞)，同位素标记单抗组C(同位素标记单抗处理后的刺激细胞+反应细胞)和阴性对照组D(反应细胞)，每个组又设为48，72，96，120小时(H)不同反应时间，收获细胞后做MTT测试;②分组如上，每组设72和120小时不同反应时间，收获细胞后做RT-PCR，并进行对比分析。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注阳性对照组A，单抗组B,同位素标记单抗组C，阴性对照组D，各组与阳性对照组相比，*尸<0.05，**尸<0.012.RT-PCR结果参见图1，其中A为IL-2，条带长度337;B为IL-IO，条带长度526;C为TNF-a，条带长度385;D为IFN-y，条带长度410;条带1:阴性对照组(反应细胞)；条带2:抗体组(抗体处理后刺激细胞+反应细胞);条带3:同位素标记抗体组(同位素标记抗体处理后剌激细胞+反应细胞)；条带4:阳性对照组(生理盐水处理后刺激细胞+反应细胞)；条带M:maker;上层光带为目的基因；下层光带为(3-actin基因。权利要求1.一种用同位素标记的抗MHCII单克隆抗体的应用，其特征是将188Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓缩，过滤后制备成188Re-2E9/13F(ab)2，构建体外单向混合淋巴细胞反应模型，并将该抗体应用于模型中，检测抗体对细胞免疫排斥抑制作用，具体通过以下步骤实现(1)制备188Re-2E9/13F(ab)2①通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓缩，置于-20℃冰箱中保存；②从188W-188Re发生器中获取188ReO42-洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成188Re-2E9/13F(ab)2片段；(2)建构体外单向混合淋巴细胞培养模型①分别设阳性对照组A，为生理盐水处理后的刺激细胞+反应细胞，单抗组B，为单抗处理后的刺激细胞+反应细胞，同位素标记单抗组C，为同位素标记单抗处理后的刺激细胞+反应细胞，阴性对照组D，为反应细胞，每个组又设为48，72，96，120小时不同反应时间，收获细胞后做MTT测试；②分组如①，每组设72和120小时不同反应时间，收获细胞后做RT-PCR，并进行对比分析。全文摘要本发明提供一种用同位素标记的单克隆抗体的应用，是将<sup>188</sup>Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓缩，过滤后制备成<sup>188</sup>Re-2E9/13F(ab)<sub>2</sub>，构建体外单向混合淋巴细胞反应模型，并将该抗体应用于模型中，检测抗体对细胞免疫排斥抑制作用。本发明改变以往运用单一方法建模的手段，结合生物学和核医学两种方法，在体外由同种异源淋巴细胞所构建的免疫排斥模型中引入了<sup>188</sup>Re标记的抗MHC-II分子的单克隆抗体2E9/13F(ab)<sub>2</sub>片段，解决了永久性下调同种异体MHCII类抗原的免疫原性问题，本发明设计合理，具有实用性和有效性，为动物体内实验和最终应用于临床提供了有力的实践支持和理论基础。文档编号G01N33/577GK101183107SQ20071007146公开日2008年5月21日申请日期2007年9月28日优先权日2007年9月28日发明者俊倪,杰刘,曹利平申请人:浙江大学