专利名称：一种固相放射性受配体结合的分析方法
技术领域：
一种固相放射性受配体结合的分析方法，属于生物医药技术领域。具体涉
及可溶性白细胞介素15受体a亚单位，即sIL-15Ra的固相放射性受配体结合的分析。
背景技术：
白细胞介素15 (Interleukin 15,IL-15)是一种与炎症及自身免疫病密切相关 的细胞因子。完整的IL-15受体(IL-15 receptor, IL-15R)是由a、 (3和y三条链 组成的异源三聚体(IL-15RaPY)。其中a链(IL-15Ra)是形成高特异、高亲和 力IL-15R的必要亚单位。
IL-15Ra是一种I型跨膜蛋白，其基因分别定位于人的第10号染色体和鼠 的第2号染色体上。全长IL-15Ra由263氨基酸残基(amino acid， aa)组成，其 中包括32aa的信号肽，173aa的胞外段，21aa的跨膜段以及37aa的胞内段。在 没有(3和Y链参与的情况下，IL-15Ra便可与IL-15高亲和力结合 (KcN10-Hmol/l)，该亲和力的大小和IL-15RoiPy与il-15之间的亲和力处于同 一数量级。参与受体复合物组成的单一亚单位具有与完整受体复合物相当的、 与相应配体结合的能力，这一不同寻常的特性使IL-15Ra成为近年来免疫学研 究的热门分子。
受配体结合分析在IL-15Ra特殊结合特性的发现中发挥了重要的作用，而 通常采用的生物膜结合分析方法存在步骤繁琐、工作量大、重现性差等缺点， 本发明使用的固相放射性受配体结合分析具有简便、快速、重现性好的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种固相放射性受配体结合的分析方法，用于可溶性 白细胞介素15受体a亚单位，即sIL-15Rot的固相放射性受配体结合的分析。
本发明的技术方案 一种固相放射性受配体结合的分析方法，将配体用 50mmol/L、 pH9.6的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板条中， 将不同浓度的放射性碘标记的受体加于各包被孔中，4"C反应2h，洗涤液清洗3 遍，取下各孔于Y计数仪上测总cpm值记为cpmt，以加入对应各孔中放射性碘 标记受体浓度200倍的未标记受体的计数值作为非特异结合cpm值记为cpmb， 各孔中放射性受配体结合的cpm值为cpmr cpmb。
要求放射性碘标记受体的放射化学纯度》95%。
所述的固相放射性受配体结合的分析方法的应用，用于可溶性白细胞介素
15受体a亚单位，即sIL-15Ra的固相放射性受配体结合的分析将配体IL-15 用50mmol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板条中， 将不同浓度的放射性碘标记的受体125I-sIL-15Ra加于各包被孔中，4"C反应2h， 洗涤液清洗3遍，取下各孔于Y计数仪上测总cpm值记为cpmt，以加入对应各 孔中放射性碘标记受体125I-sIL-15Ra浓度200倍的未标记受体sIL-15Ra的计数 值作为非特异结合cpm值记为cpmb，各孔中放射性受配体结合的cpm值为 cpm = cpmt- cpmb。
要求放射性碘标记受体125I-sIL-15Ra的放射化学纯度》95%。
所述的sIL-15Ra的放射性碘标记采用氯胺T法sIL-15Ra冻干品用pH7.4、 100mmol/L的磷酸缓冲液溶解成lmg/ml工作液，于该工作液中加lmCi 1251 混匀，加入10吗氯胺T后室温反应lmin，加50吗偏重亚硫酸钠终止反应，过 PD-10柱分离纯化碘标蛋白125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 5Ommol/L的磷酸缓冲液洗 脱，收集10滴/管的洗脱液，每管取10^d测放射性计数cpm值。
所述的方法，其中sIL-15Ra的放射化学纯度测定取氯胺T法碘标记后的 各管洗脱液，采用三氯醋酸沉淀法测定各管的放射化学纯度，计算公式为放 射化学纯度％= (cpm沉淀+cpm总)xl00%;
其中cpm沉淀为加入三氯醋酸后经离心所得沉淀的cpm值，
cpm总为加入三氯醋酸前碘标蛋白的cpm值。
本发明的有益效果受配体结合分析在IL-15Ra特殊结合特性的发现中发 挥了重要的作用，目前采用的生物膜结合分析方法存在步骤繁琐、工作量大、 重现性差等缺点，本发明使用的固相放射性受配体结合分析具有简便、快速、 重现性好的特点。
图1 sIL-15Ra诱导表达的SDS-PAGE分析 图2 125I-sIL-15Ra放射化学纯度的三氯醋酸沉淀法测定 图3 sIL-15Ra与IL-15的受配体结合的Scatchard分析
具体实施例方式
实施例1
1. sIL-15Ra基因克隆、重组表达及纯化根据GenBank中鼠IL-15Ra的cDNA 序列，设计sIL-15Ra编码序列的引物对；Trizol法提取小鼠脾脏细胞总RNA， 以01igoT为引物合成cDNA第一链，并以此为模板进行PCR扩增；PCR产物 与pMD18-T simple载体连接，得pMD18-T/s/L-A5i a重组质粒，再与表达载体 pQE-30连接，获pQE-30/s几-"i cc重组表达质粒，并转化至M15感受态细菌， 通过降低诱导温度和异丙基-(3-D-硫代半乳糖浓度的方式实现了重组蛋白的可溶 性表达，进而通过与Ni-NTA金属螯合柱选择性结合实现了重组蛋白的一步纯
化。每升菌中可纯化得到约7mg重组蛋白，纯度大于95%。以CTLL-2细胞为 靶的生物学活性分析结果显示，纯化所得的重组蛋白sIL-15Rct能够特异地协同 IL-15发挥相应的促细胞增殖效应。
2. sIL-15Ra的放射性碘标记sIL-15Ra的放射性碘标记采用氯胺T法。具 体步骤如下取sIL-15Ra冻干品用pH 7.4、 100mmol/L的磷酸缓冲液溶解成 lmg/mL工作液，于10fiL该工作液中加lmCi 1251混匀，加入IO吗氯胺T后室 温反应lmin，加50pg偏重亚硫酸钠终止反应，过PD-10柱分离纯化碘标蛋白 125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 50mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集10滴/管的洗脱液， 每管取10pL测放射性计数cpm值。125I-sIL-15Ra的放射化学纯度测定采用三氯 醋酸沉淀法，即取碘标记后的各管洗脱液，加入三氯醋酸沉淀蛋白，样品经离 心后吸除上清，然后测定沉淀的放射性。放射化学纯度的计算公式为放射化 学纯度％= (cpm沉淀+cpm总)xioo%;
其中cpm沉淀为加入三氯醋酸后经离心所得沉淀的cpm值， cpm总为加入三氯醋酸前碘标蛋白的cpm值。 经检测，125I-sIL-15Ra的放射化学纯度>95%。
3. sIL-15Rct与IL-15间亲和力的固相放射性受配体结合分析将配体IL-15 用50mmol/L、 pH 9.6的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板条 中，将不同浓度的放射性碘标记的受体^I-sIL-15Ra加于各包被孔中，4'C反应 2h，洗涤液清洗3遍，取下各孔于Y计数仪上测总cpm值记为cpmt，以加入未 标记受体sIL-15Ra所测得的计数值作为非特异结合cpm值记为cpmb，该未标记 受体sIL-15Ra的浓度为碘标记受体125I-sIL-15Ra浓度的200倍。各孔中放射性 受配体结合的cpm:cpmt-cpmb。所得结果经Scatchard作图分析显示，重组表 达的sIL-15Ra与IL-15之间具有极高的亲和力，Kd = 49.26pM。
权利要求
1、一种固相放射性受配体结合的分析方法，其特征是将配体用pH9.6、50mmol/L的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板条中，将不同浓度的放射性碘标记的受体加于各包被孔中，4℃反应2h，洗涤液清洗3遍，取下各孔于γ计数仪上测总cpm值记为cpmt，以加入对应各孔中放射性碘标记受体浓度200倍的未标记受体的计数值作为非特异结合cpm值记为cpmb，各孔中放射性受配体结合的cpm值为cpmt-cpmb；要求放射性碘标记受体的放射化学纯度≥95％。
2、 权利要求l所述的固相放射性受配体结合的分析方法的应用，其特征是 用于可溶性白细胞介素15受体a亚单位，即sIL-15Ra的固相放射性受配体结合 的分析将配体IL-15用pH 9.6、 5Ommol/L的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可 拆卸式96孔微孔板条中，将不同浓度的放射性碘标记的受体125I-sIL-15Ra加于 各包被孔中，fC反应2h，洗涤液清洗3遍，取下各孔于y计数仪上测总cpm值 记为cpmt，以加入对应各孔中放射性碘标记受体125I-sIL-15Ra浓度200倍的未 标记受体sIL-15Ra的计数值作为非特异结合cpm值记为cpmb,各孔中放射性 受配体结合的cpm值为cpmt- cpmb;要求放射性碘标记受体125I-sIL-15Ra的放射化学纯度》95%。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征是sIL-15Ra的放射性碘标记，采用 氯胺T法sIL-15Ra冻干品用pH7.4、 10Ommol/L的磷酸缓冲液溶解成lmg/mL 工作液，于10pL该工作液中加lmCi 1251混匀，加入IO吗氯胺T后室温反应 lmin，加50吗偏重亚硫酸钠终止反应，过PD-10柱分离纯化碘标蛋白 125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 50mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集10滴/管的洗脱液， 每管取10nL测放射性计数cpm值。
4、 根据权利要求2所述的方法，其特征是125I-sIL-15Ra的放射化学纯度测 定取氯胺T法碘标记后的各管洗脱液，采用三氯醋酸沉淀法测定各管的放射 化学纯度；计算公式为放射化学纯度％= (cpm縱+cpm总)xlOO%， 其中cpm縱为加入三氯醋酸后经离心所得沉淀的cpm值， cpm总为加入三氯醋酸前碘标蛋白的cpm值。
全文摘要
一种固相放射性受配体结合的分析方法，属于生物医药技术领域。本发明将配体用pH 9.6、50mmol/L的碳酸盐缓冲液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板条中，将不同浓度的放射性碘标记的受体加于各包被孔中，4℃反应2h，洗涤液清洗3遍，取下各孔于γ计数仪上测总cpm值记为cpm<sub>t</sub>，以加入对应各孔中放射性碘标记受体浓度200倍的未标记受体的计数值作为非特异结合cpm值记为cpm<sub>b</sub>，各孔中放射性受配体结合的cpm值为cpm<sub>t</sub>-cpm<sub>b</sub>；要求放射性碘标记受体的放射化学纯度≥95％。本发明方法应用于可溶性白细胞介素15受体α亚单位，即sIL-15Rα的固相放射性受配体结合的分析。
文档编号G01N33/53GK101178401SQ20071019061
公开日2008年5月14日 申请日期2007年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者曹国宪, 李文新, 杨润琳, 俊 范, 蒋孟军, 蔡刚明, 邹美芬 申请人:江苏省原子医学研究所