专利名称：检测人b淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地说是涉及检测人B淋巴细胞刺激因子 的酶联免疫试剂盒及其制备方法。 相关领域描述B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)又名为BLyS (B lymphocyte stimulator)、 THANK (TNF homology that activates apoptosis ， nuclear factor-KB and c-Jun NH2- terminal kinase)、及TAIX-1 (TNF-and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)，是月中瘤坏死因子超 家族(TNF)的第17位成员，它能与B淋巴细胞特异结合并诱导其增殖、分化 并分泌IgG、 IgA和IgM等免疫球蛋白，在体液免疫反应中发挥着重要作用。现 已确定，BAFF与多种身免疫性疾病的发病机理有关，包括自系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、干燥综合症等。人BAFF (GenBank序列号AF116456)全长为285个氨基酸，其中47-73 氨基酸为跨膜区，74-285氨基酸为胞外区，通常在某些特定的蛋白酶(如弗林蛋 白酶)的作用下发生水解，形成可溶性功能片段sBAFF(C端A134-L285)。 BAFF 的空间结构具有如下特点单体呈锲形(wedge-like)样的(3"三明治"结构，由两 个平行的(3折叠片层组成，分别含有5条P折叠股；BAFF以同源三聚体的形式 发挥生物学作用。BAFF与肿瘤坏死因子家族的另一个成员增值诱导配体(a proliferation inducing ligand, APRIL)具有高度的同源性。文献广泛报道，自身免疫性疾病如红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性干燥 症等病人体内B淋巴细胞刺激因子(BAFF)含量升高；最新的研究发现，淋巴 瘤、自身免疫性肝炎、HIV病人体内BAFF含量也升高。因此研制高灵敏度的 人BAFF检测试剂盒，对于愈后指标检测等是极为必要的。 发明内容本发明的目的是提供一种检测人B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的酶联免疫 试剂盒。本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。本发明的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，包括包被纯化的 人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP 标记的链酶亲和素。上述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其中固相载体是常 规的，优选96孔聚苯乙烯酶标板。所说的人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体为 鼠源，多克隆抗体为兔源。人B淋巴细胞刺激因子标准品为大肠杆菌重组表达 后纯化的产物。为了方便使用，所说的试剂盒还包括人B淋巴细胞刺激因子标准品蛋白、 显色剂、终止液、浓縮洗涤液、样品稀释液。所述浓縮洗涤液为含lMTween20的磷酸缓冲液，显色剂由显色液A液和 显色液B液组成，显色液A为过氧化氢，显色B液为邻苯二胺(OPD)，反应终 止液为H2S04;样品稀释液是0.5 % BSA， 0.05 % Tween 20， 5mM EDTA， 0.35M NaCl， pH7.2的PBS。本发明的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤(1) 抗原的制备将克隆的人B淋巴细胞刺激因子基因在大肠杆菌中表达， 得到的融合蛋白，经纯化后作为抗原；(2) 抗体的制备将(1)中的的抗原免疫兔制备特异性的人B淋巴细胞刺激 因子多克隆抗体；复苏分泌人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的杂交瘤细胞并注射入小鼠腹腔，收集腹水，制备人B淋巴细胞剌激因子单克隆抗体；(3) 抗体的纯化(2)中所得的人B淋巴细胞刺激因子多克隆抗体和单克隆 抗体分别经离心、沉淀、亲和层析，得到纯化抗体；(4) 抗体的标记用生物素标记(3)中所得到的纯化多克隆抗体；(5) 试剂盒的制备用(3)中所得的纯化单克隆抗体包被固相载体。 本发明的试剂盒的使用方法，包括以下操作步骤-(1) 将检测样本与固定于固相支持物的捕捉试剂接触和保温。其中捕捉试剂 是抗人BAFF的单克隆抗体。(2) 将检测抗体与结合于捕捉抗体上的检测样本接触和保温。检测抗体为生物素标记的抗人BAFF的多克隆抗体。(3)用HRP标记的链酶亲和素特异性地捕捉结合于检测抗体上的生物素，并 用显色剂显色，从而测定结合于捕捉抗体的BAFF水平。本发明建立了双抗体夹心法测定样品中B淋巴细胞刺激因子水平，测定灵 敏度可达1 ng/ml，为B淋巴细胞刺激因子检测提供了有效的检测手段。 附图
描述图l是人BAFF可溶性区段基因的表达结果。BL21(DE3)/pET30a-hsBAFF 菌经诱导后超声破碎细胞，用包涵体洗涤液洗涤包涵体，取样进行12% SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色，结果如图所示，大部分杂蛋白被洗去。割 胶回收目的条带可用作抗原。1 Marker; 2诱导前全菌；3诱导后全菌；4包涵 体。图2是人BAFF多克隆抗体的纯化结果。12% SDS-PAGE结果显示，纯化后 的多克隆抗体有明显的两条带，分别为相对分子量为25 000 KDa左右的轻链和相 对分子量为50 000KDa左右的重链。1 Marker; 2多抗血清；3-4纯化后抗体图3是人BAFF单克隆抗体的纯化结果。小鼠腹水纯化后，12%SDS-PAGE 结果如图所示，纯化后的多克隆抗体有明显的两条带，分别为相对分子量为25 000 KDa左右的轻链和相对分子量为50 000 KDa左右的重链。M Marker; 1纯化 前腹水；2-3纯化后单克隆抗体图4是人BAFF双抗体夹心法检测的标准曲线。实验数据运用SPSS软件分 析进行拟合分析，结果如图所示，在1-100 ng/ml之间，曲线性较好112=0.995。 回归曲线方程为Y-0.534 + 0.433 lnX具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。大肠杆菌BL21/pET 30a-hsBAFF由申请人保存，可向公众提供，其构建参 见(P. Cao et al. / Protein Expression and Purification 41 (2005) 199—206)。 实施例l、抗体的制备1多克隆抗体的制备(1)抗原制备在大肠杆菌BL21/pET30a-hsBAFF中诱导表达hsBAFF基因，超声破碎细胞后收集包涵体。用包涵体溶解液(8M尿素，20mMTris-Cl，pH8.3， lmMEDTA,5mM e-巯基乙醇)4 t:过夜溶解包涵体，离心取上清，加入不含e-巯基乙醇的上样缓冲液(注意样品不用煮沸)，进行12% SDS-PAGE。电泳结束后，去 离子水清洗凝胶，用冰冻的0，25mol/lKCl显色，目的条带相应位置呈现乳白色。 切割目的条带并充分碾磨，装入2ml注射器，准备免疫。结果如图l所示。(2) 免疫方案免疫方法为腹部皮下多点注射抗原，每次免疫量为l mg。每隔15天免疫一 次，第三次免疫结束10天后，耳静脉采血检测抗血清效价，若效价大于30， 000， 准备收集血清；若效价小于30， 000，加强免疫一次。(3) 分离抗血清心脏采血，将血液在37 。C放置2小时后，转移到4 。C冰箱过夜，收集析出 液，离心，上清即为多抗血清。分装血清，-70 'C保存。 2单克隆抗体的制备采用体内诱生法制备单克隆抗体。复苏分泌人B淋巴细胞刺激因子单克隆 抗体的杂交瘤细胞，并用RPMI 1640培养液大量培养。取6-8周龄的Bal b/c小 鼠每只腹腔注射0.5ml石蜡油，1周后每只小鼠注射1X1()S杂交瘤细胞。待小鼠 腹部明显膨大到一定成都时，抽取腹水，反复收集数次。腹水经12， 000 g离心 20min后，分装-70 。C保存。 实施例2、抗体的纯化及标记1多克隆抗体的纯化(1) 50%饱和硫酸铵沉淀样品多抗血清中加入1/10体积1 mol/LTris-HCI， pH8.0，然后一边搅拌一边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4°C，搅拌4小时。 12， 000rpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (PBS) 溶解沉淀。(2) 33%饱和硫酸铵沉淀样品把上述溶液中加入1/10体积1 mol/L Tris-HCI， pH8.0，然后一边搅拌一边加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，4°C，搅 拌4小时。12， 000 rpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的PBS溶解沉淀。 重复一次。(3) 脱盐用PBS透析上述溶液，中间换三次液。(4) 利用Biologic LP层析系统，样品液以0.5 ml/min流速上样至结合缓冲 液(20mM磷酸钠，pH7.4， 150mM NaCI)预平衡的rProtein ASepharose FastFlOW亲和层析柱；(5) 用结合缓冲液以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；(6) 用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸一HCI， pH 3.0)以0.5 ml/min流速洗 脱抗体，至流出液OD280值到达基线，用含1/10柱体积的1 mol/l Tris-HCI (pH 8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性；(7) 取所收集的溶液10 |J|，进行12Q/o SDS-PAGE分析。 多克隆抗体的纯化结果如图2所示。2单克隆抗体的纯化(1) 50%饱和硫酸铵沉淀样品小鼠腹水中加入1/10体积1 mol/L Tris-HCI， pH8.0，然后一边搅拌一边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4°C，搅拌4小时。 12， OOOrpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的PBS溶解沉淀。(2) 脱盐用PBS透析上述溶液，中间换三次液。(3) 利用Biologic LP层析系统，样品液以0.5 ml/min流速上样至结合缓冲 液(20mM磷酸钠，pH7.4， 150mM NaCI)预平衡的rProtein ASepharose FastFlOW亲和层析柱；(4) 用结合缓冲液以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；(5) 用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸一HCI， pH 3.0)以0.5 ml/min流速洗 脱抗体，至流出液OD280值到达基线，用含1/10柱体积的1 mol/l Tris-HCI (pH 8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性；(6) 取所收集的溶液10 |J|，进行12% SDS-PAGE分析。 单克隆抗体的纯化结果如图3所示。3间接ELISA测定纯化后抗体效价用10 pg/ml hsBAFF包被酶标板，每孑L 100 |jl， 4'C过夜，用洗涤缓冲液洗 3次，每次3min; 5%脱脂奶粉37'C封闭2 h;取纯化后单抗或者多抗梯度稀 释，每孔加入100pl，以骨髓瘤细胞培养液或者免疫前血清为阴性对照，以抗体 的稀释液为空白对照，每个样设3个重复，置37'C孵育1 h，然后洗涤；加入 1: 1000稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体或者羊抗兔IgG抗体，置37"C孵育lh，然后洗涤；各反应孔中加入临时配制的显色剂溶液100nl，室温反应20 min;各反应孔中加入2 M硫酸50 |JI;在ELISA检测仪上490 nm读数，以空 白对照孔调零后测各孔OD值。抗体效价以稀释度表示，检测结果以(A样品一A空白)/ (A眺对照一A空白)》 2.1为阳性，以阳性孔对应的最高稀释倍数为效价。间接ELISA测定，纯化后单 克隆抗体的效价为106;多克隆抗体的效价为8X104。4纯化多克隆抗体的标记(1) 用无水DMS0配置5mg/ml生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯(Biotin-NHS) (sigma)溶液。(2) 用0.1mol/L,pH9.5碳酸盐缓冲液透析纯化后多克隆抗体，并浓縮抗体 浓度至l-3mg/ml。(3) 按照100 pg/ml的比率将生物素酯加入抗体溶液中，混合均匀并在室温 下孵育4小时。(4) 每250吗生物素酯内加入20 nl 1 mol/L氯化铵，室温孵育10分钟。(5) 用0.15mol/LPBS (pH7.4)充分透析上述溶液 实施例3、检测人BAFF的酶联免疫试剂盒1所用试剂的配置a. BAFF标准品溶液lmg/ml人BAFF标准蛋白0.5ml。b. 浓縮洗涤液l%Tween20的磷酸盐缓冲液(0.15M， pH 7.4)，为正常使 用浓度的10-15倍。c. 样品稀释液0.5%BSA， 0.05%Tween20， 5mMEDTA， 0.35MNaCl， pH7.2的PBS。d. 检测抗体lmg/ml生物素标记的人BAFF多克隆抗体0.2ml。e. HRP标记的链酶亲和素lmg/ml0.1ml。f. 底物显色液A液过氧化氢10ml。g. 底物显色液B液邻苯二胺(OPD) 10ml。h. 终止液2M硫酸，10ml。 2抗体最佳工作浓度的选择应用棋盘滴定法。用包被缓冲液把BAFF单克隆抗体稀释至2.5、 5.0、 10和20 pg/mL，分别在酶标板上进行包被，每一个浓度包被3个横行，洗涤；在第一 个横行各包被孔中加入强阳性抗原液(200ng/mlBAFF蛋白溶液)，在第二个横 行中加入弱阳性抗原液(l ng/mlBAFF蛋白溶液)，第三横行加入阴性对照液(样 品稀释液)，温育，洗涤；用样品稀释液将生物素标记BAFF多克隆抗体稀释成4 个浓度2、 4、 8、 16pg/mL。每个浓度加入两个纵行，温育，洗涤；加入l: 12 000 稀释的HRP标记的链酶亲和素，温育，洗涤；加入显色剂显色，加终止液终止反 应，读取A490值。以强阳性抗原的A490值在2左右，阴性参考的A490值小于0.1 的条件作为最适条件，据此选择包被抗体和生物素标记抗体的工作浓度。BAFF 单克隆抗体的最适包被浓度是IO pg/mL，生物素标记多克隆抗体的最适工作浓度 是8 jxg/mL。3抗BAFF单克隆抗体包被板的制备用包被缓冲液(pH 9.6 0.05 M碳酸钠)将hBAFF单抗稀释至10pg/mL，酶 标板每孔中加100 ^， 4°C 12小时。弃去包被液，用洗涤液(PBS， pH7.4-Tween 20， 0.05%)洗涤各孔四次，每次两分钟，随之拍干。每孔加入封闭液(2%BSA， 0.01%硫柳汞，PBS) 200^1， 4 。C封闭4小时，随后弃去封闭液，洗涤三次， 拍干，室温干燥24小时。干燥后的酶标板迅速真空封口包装，保存于2-8 'C。4试剂盒检测操作程序 (1)加样用样品稀释液将hsBAFF稀释至200 ng/ml—0.05 ng/ml，每孔加 10(HiL;阴性对照孔，每孔加100pL样品稀释液。每个样设三个重复。37 。C温育 1小时。用洗涤液洗涤四次。(2) 生物素标记多克隆抗体用样品稀释液将生物素标记抗体稀释至8 吗/mL，加入样孔中，每孔100^L。 37'C温育1小时。洗涤六次。(3) HRP-链酶亲和素用0.1% BSA将HRP-链酶亲和素储液按1: 12000稀释， 分别加入设计好的样孔中，每孔100pL。 37 'C温育1小时。洗涤六次。(4) 检测每个样孔中加入新鲜配置的显色液50pL，室温(18-25 。C)静置 25分钟。每个样孔中加入反应终止液(2MH2S04) 50pL。在酶标仪490 nm下 读数。5检测范围测定将hsBAFF稀释至200ng/ml， 100 ng/ml， 50 ng/ml， 25 ng/ml， 12.5 ng/ml，6.3ng/ml， 3.2ng/ml， 1.6ng/ml， 0.8ng/ml， 0.4ng/ml， 0.2ng/ml， 0.1 ng/ml， 0.05 ng/ml，加入到ELISA系统中进行检测。以hsBAFF浓度为横坐标，A490为纵坐 标，运用CurveExperl.38ELISA标准曲线拟合软件分析并绘制标准曲线。结果如 图4所示，在l-100ng/ml之间，曲线性较好R^0.995。回归曲线方程为Y=0.534 + 0.433 lnX。6特异性检测稀释hsAPRIL至50ng/ml， 25ng/ml， 12.5ng/ml， 6.3ng/ml， 3.2ng/ml, 1.6 ng/ml， 0.8ng/ml，分别加入ELISA系统中进行检测。结果表明，即使hsAPRIL浓 度达到50 ng/ml，也没有观察到明显的交叉反应或者干扰。7精确度检测批内精确度分析取三份己知浓度的BAFF样品，在同一块酶标板上检测20 次，计算变异系数(CV)。批间精确度分析取已知浓度的BAFF样品，在多块 酶标板上分别检测，计算变异系数(CV)。实验结果表明，不论是批内还是批间， 变异系数(CV)都在10%以内。
权利要求
1.一种检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，包括包括包被纯化的人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP标记的链酶亲和素。
2、 如权利要求1所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其 特征在于，还包括还包括人B淋巴细胞刺激因子标准品蛋白、显色剂、终止液、 浓縮洗涤液、样品稀释液。
3、 如权利要求2所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其 特征在于，所说的人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体为鼠源，多克隆抗体为兔 源；所述浓縮洗涤液为含l。/。Tween20的磷酸缓冲液，显色剂由显色液A液和 显色液B液组成，显色液A为过氧化氢，显色B液为邻苯二胺，反应终止液为 H2S04;样品稀释液是0.5。/oBSA， 0.05 % Tween 20， 5mMEDTA， 0.35MNaCl， pH7.2的PBS。
4、 一种制备权利要求1所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤(1) 抗体的制备用hsBAFF分别免疫小鼠和兔子，制备人B淋巴细胞刺 激因子的单克隆抗体和多克隆抗体；(2) 抗体的纯化(1)中所得的抗体经离心、沉淀、亲和纯化，得到纯化抗体；(3) 抗体的标记用生物素标记(2)中所得到的纯化多抗；(4) 试剂盒的制备用(2)中所得的纯化单克隆抗体包被固相载体。
全文摘要
本发明提供了一种检测人B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的酶联免疫试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括包被纯化的人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP标记的链酶亲和素。其制备方法包括抗原、抗体的制备，抗体的纯化，纯化抗体的标记，试剂盒的制备等步骤；本发明的试剂盒，检测灵敏度可达1ng/ml，为BAFF的研究提供了有效的检测手段。
文档编号G01N33/577GK101271113SQ200810025340
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者芳 任, 张双全 申请人:南京师范大学