专利名称：：测定母乳中合成麝香浓度的方法
技术领域：
：本发明涉及一种可稳定检测母乳中合成麝香浓度的方法，通过凝胶色谱柱化学预处理方法以及气相色谱与质谱联用技术相结合的方法来达到测定母乳中合成麝香浓度的目的。本发明属有机化学物质的物理化学分析测定
技术领域：
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背景技术：
：合成麝香作为人工合成的有机化合物，以其优雅的芳香气味、优良的定香能力及低廉的价格，取代了天然麝香，广泛应用于化妆品、洗涤用品、护肤品、香水等产品中，成为香精香料行业中主要成分之一。中国是世界上合成麝香生产大国之一，从70年代就开始研制合成麝香，于1993年获卫生部批准为一类新药并进行试生产，到2000年底己以销定产的形式销售数千千克，其中2000年一年的销售量即达1000Kg，占全国麝香市场年总供应量的1/31/2,但是目前关于合成麝香在国内环境中的存在和分布的研究还非常少，因此对于开展环境以及人体中合成麝香含量水平的研究是非常必要的。人工合成麝香可以分为3类硝基麝香化合物、多环麝香化合物和大环麝香化合物。其中硝基麝香包括麝香酮(MK)和二甲苯麝香(MX)等，由于硝基麝香具有潜在的致癌性，许多国家已禁止使用；多环麝香又包括萨利麝香(ADBI)、粉檀麝香(AHMI)、特拉斯(ATII)、佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)等；大环麝香化合物主要有2类，分别为酮类物质和内酯类物质，由于成本较高使用得较少。本发明主要测定的是母乳中硝基麝香以及多环麝香的浓度。合成麝香化合物广泛分布于各个领域，具有较强的生物富集能力和一定的毒副作用，其在环境中的分布、迁移转化及对环境生态和人类健康潜在的危险引起了环境工作者的关注。继1994年首次在环境中检测到多环麝香后，在随后的10多年里，先后在表层水，水体悬浮颗粒物，沉积物，污水处理厂的源水、出水和污泥，大气，以及鱼、虾、贝类等生物体内均检测出合成麝香，饮用水中也检测到了佳乐麝香和吐纳麝香，甚至在人体的脂肪组织、血液和母乳中也有上述两种物质的存在。有研究表明，人工合成麝香能诱导其它毒性物质使其毒性增强。Liickenbach等(2004)的研究发现，人工合成麝香能抑制贻贝对有毒物质的自然抵抗力，而且这种影响在暴露发生很长时间后还能持续。早在1994年，Rimkus(1994)就指出，人工麝香化合物能在包括人乳在内的脂肪组织中蓄积，并且在暴露后仍能在人体组织中滞留很长时间。许多研究表明，合成麝香具有环境激素效应和遗传毒性效应，有报道指出，硝基麝香化合物(麝香酮和二甲苯麝香)以及多环麝香化合物(佳乐麝香和吐呐麝香)是内分泌干扰物质。Seinen(1999)对老鼠每隔4d注射140ngl7b-雌二醇(一种雌激素)，持续2周，发现母体老鼠子宫质量增加了2倍，胸腺的质量却减为原来的50%;而当老鼠每天服用15或50mg七"吐纳麝香，或者服用50或300mg七—H圭乐麝香2周时，老鼠的体重、子宫质量、胸腺质量与对照没有显著差异；当老鼠受到50mg'L"吐纳麝香禾B300mg丄"佳乐麝香处理时，肝脏的质量显著增加。人工合成麝香的遗传毒性，首先表现在影响生殖能力方面。Carlsson等(2000)研究雌性斑马鱼先与未暴露麝香酮的雄性鱼交配产卵，然后摄入麝香酮8周，共设2个浓度处理(低处理浓度为O.lmg，g",高处理浓度为10mgf1)，以检测麝香酮在鱼体内的生物蓄积性及其对生殖能力的影响。结果表明，雌性斑马鱼的体重、体长、肝脏指数和性腺指数均减少；生殖能力与污染物的浓度存在剂量——效应关系，即随着污染物浓度增加产卵能力逐渐下降，以上研究表明合成麝香化合物可以对母体产生强烈的毒性，继而通过母乳传递到孩子体内，因此有必要检测母乳中合成麝香物质的含量。目前，对于人体中合成麝香的研究在我国还处于初级阶段，还未有文献明确发表过关于母乳中合成麝香测定方法，因此，本发明对于研究人体中合成麝香的水平以及评价合成麝香对人体的影响有着积极的意义。
发明内容本发明的目的是提供一种能够稳定检测母乳中合成麝香浓度的方法。本发明，一种测定母乳中合成麝香浓度的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤A、液液萃取和恒重脂肪量取5ml母乳样品放入分液漏斗中，加入0.01吗回收率指示物D10-菲，随后加入811118%的草酸钾和10ml乙醇充分摇匀，再加入5ml的乙醚振荡，将上述混合液进行液液萃取；先加入20ml正己垸，充分振荡，静置分层，待液面分层后，进行分液，取上层清液倒入鸡心瓶中，待用；将收集到的下层浑浊液再倒入分液漏斗中，加入10ml正己烷，充分振荡，静置分层，取上层清液倒入原待用的鸡心瓶中；下层浑浊液按上述同样方法逐级重复萃取两次，之后弃去下层浑浊液；将并和收集于原鸡心瓶中的澄清液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至体积2~3ml;然后转移至事先称重的棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，放于千燥器中恒重2天，将恒重的脂肪称量，记录下脂肪重量；B、上凝胶色谱柱(GPC柱)处理将上述恒重的脂肪用少量正己烷和二氯甲垸的混合液溶解，两者的体积比即正己烷二羞甲烷=1:1;然后过凝胶色i普柱(GPC柱)；该柱填料为—Jio-BeadsS-X3凝胶，其作用是使母乳通过GPC柱而分离去除其中的脂肪；淋洗液为165ml的正己垸和二氯甲烷(v/v=l:l)的混合液，用量筒接取前65ml的淋洗液，弃去，然后用100ml的量筒接取剩余的100ml淋洗液，将该淋洗液转移至鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，待用；C、过硅胶小柱处理将上述待用的2ml溶液过硅胶小柱处理，该柱中主要装有一定高度的硅胶，其作用主要是去除溶液中的杂质；先加入15ml正己垸进行淋洗，弃去淋洗液，再加入30ml二氯甲烷进行淋洗，用量筒接取30ml二氯甲烷淋洗液，转移至鸡心瓶中，将该淋洗液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，将溶液转移到棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，待用；D、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测在上述棕色小瓶中加入1^110ppm六甲基苯作为内标，以及49nl的正己垸，进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测；色谱仪条件及质谱仪条件分别如下色谱条件DB-5G0mx0.25mmi.d"0.25|im)或HP-5(30mx0.25mmi.d.,0.25)xm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.0ml/min，无分流进样，进样量为1^1;进样口温度290'C;柱始温100。C(lmin)，7'C/min升至16CTC，3'C/min升至180°C，rc/min升至190°C，10°C/min升至280。C，后运行300。C(5min);质谱条件电子电离(EI)源；离子源温度20(TC，界面温度280'C;选择性离子分段扫描(SIM)，六甲基苯的扫描离子为m/z147、162;佳乐麝香(HHCB)243、258、213;吐纳麝香(AHTN)243、258、201、159;酮麝香(MK)279、294;二甲苯麝香(MX)282、297;D10-菲188;溶剂切除时间8min;E、浓度计算a、绘制标准曲线分别用混标配制不同浓度的溶液；用四种目标合成麝香化合物，即佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)、酮麝香(MK)、二甲苯麝香(MX)四种目标化合物及回收率指示物DlO-菲，配制成浓度分别为10^g/l、20pg/l、40ng/l、100ng/l、200pg/l、500|ig/l、1000叫/1七个不同浓度的标准样品溶液；并加入浓度为10(Hig/1的内标六甲基苯；将上述标准样品溶液进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，测得各浓度点相应值；读出标准样品中这四个目标化合物的峰面积(S标目)以及内标化合物的峰面积(S标内)，将两者的比值，即相对响应值R二S标巨/S标内，并以R作为纵坐标，浓度C为横坐标，作为四个目标麝香化合物的标准曲线；b、浓度计算主要采用内标法进行计算；通过前述母乳液的气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的分离和分析，读出母乳液中各个目标化合物的峰面积(HHCB、AHTN、MK、MX)B卩S目，以及内标六甲基苯的峰面积即Sft，S目与SA的比值即为响应值R，再根据对应的目标化合物的标准曲线的斜率a，求出对应的目标麝香化合物浓度C5fe际；具体计算公式如下C=R/a式中C——浓度(单位吗/1)R——相对响应值，R=Sg/S内a~~相对应标准曲线的斜率为了保证消除背景干扰，根据上述公式，先计算出空白实验的浓度Ce白，将C实际减去C空白的值，乘以样品定容的体积，再除以母乳脂肪恒重后所称得的重量，最终所得的结果就是母乳中合成麝香的浓度，艮P:C样品浓f(C实际一C空白)x定容的体积(ml)/脂肪重量(g)。空白实验即用蒸馏水代替前述母乳进行上述四个步骤的预处理过程。本发明方法结合各类文献中检测PBDEs、PCBs等处理方法能有效稳定检测母乳中合成麝香的浓度，是一种较合适的较高正确度的方法。图1.为本发明中合成麝香标样的图谱图2.为本发明中基质加标中合成麝香物质的图谱图3.为母乳样品中合成麝香的图谱图4.为实验例中AHTN的标准曲线图具体实施方式现将本发明的具体实施例叙述于后。实施例1:本实施例中，测定方法的过程和步骤如下1、液液萃取和恒重脂肪量取5ml母乳样品放入分液漏斗中，加入0.01(xg回收率指示物D10-菲，随后加入8ml8%的草酸钾和10ml乙醇充分摇匀，再加入5ml的乙醚振荡，将所述混合液进行液液萃取；先加入20ml正己垸，充分振荡，静置分层，待液面分层后，进行分液，取上层清液倒入鸡心瓶中，待用；将收集到的下层浑浊液再倒入分液漏斗中，加入10ml正己烷，充分振荡，静置分层，取上层清液倒入原待用的鸡心瓶中；下层浑浊液按上述同样方法逐级重复萃取两次，之后弃去下层浑浊液；将并和收集于原鸡心瓶中的澄清液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至体积23ml;然后转移至事先称重的棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，放于干燥器中恒重2天，将恒重的脂肪称量，记录下脂肪重量；2、上凝胶色谱柱(GPC柱)处理将上述恒重的脂肪用少量正己烷和二氯甲烷的混合液溶解，两者的体积比即正己垸二氯甲烷=1:1;然后过凝胶色谱柱(GPC柱)；该柱填料为Bio-BeadsS-X3凝胶；其作用是使母乳通过GPC柱而分离其中的脂肪；淋洗液为165ml的正己垸和二氯甲垸(v/v=l:l)的混合液；用量筒接取前65ml的淋洗液，弃去，然后用100ml的量筒接取剩余的100ml淋洗液，将该淋洗液转移至鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，待用；3、过硅胶小柱处理将上述待用的2ml溶液过硅胶小柱处理，该柱中主要装有一定高度的硅胶，其作用主要是去除溶液中的杂质；先加入15ml正己垸进行淋洗，弃去淋洗液，再加入30ml二氯甲烷进行淋洗，用量筒接取30ml淋洗液，转移至鸡心瓶中，将该淋洗液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，将溶液转移到棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，待用；4、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测在上述棕色小瓶中加入lnllOppm六甲基苯作为内标，以及49pl的正己烷，进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测；色谱仪及质谱仪条件分别如下色谱条件DB-5G0mx0.25mmi.d.,0.25pm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.0ml/min，无分流进样，进样量为1^1;进样口温度290。C;柱始温IO(TC(lmin)，7°C/min升至160。C，3。C/min升至180°C，l°C/min升至190°C，10°C/min升至280°C，后运行300°C(5min);质谱条件电子电离(EI)源；离子源温度20(TC，界面温度28(TC;选择性离子分段扫描(SIM)，六甲基苯的扫描离子为m/z147、162;佳乐麝香(HHCB)243、258、213;吐纳麝香(AHTN)243、258、201、159;酮麝香(MK)279、294;二甲苯麝香(MX)282、297;D10-菲188;溶剂切除时间8min;5、浓度计算a、绘制标准曲线分别用混标配制不同浓度的溶液；用四种目标合成麝香化合物，即佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)、酮麝香(MK)、二甲苯麝香(MX)四种目标化合物及回收率指示物DlO-菲，配制成浓度分别为10吗/1、20pg/1、40pg/1、100吗/1、200吗/1、500吗/1、1000吗/1七个不同浓度的标准样品溶液；并加入浓度为100吗/1的内标六甲基苯；将上述标准样品溶液进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，测得各浓度点相应值；读出标准样品中这四个目标化合物的峰面积(S标H)以及内标化合物的峰面积(Ss内)，将两者的比值，即相对响应值I^S标目/S标内，并以R作为纵坐标，浓度C为横坐标，作为四个目标麝香化合物的标准曲线；b、浓度计算主要采用内标法进行计算，通过前述母乳液的气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的分离和分析，读出母乳液中各个目标化合物的峰面积(HHCB、AHTN、MK、MX)即Sg，以及内标六甲基苯的峰面积即S内，Ss与S内的比值即为响应值R，再根据对应的目标化合物的标准曲线的斜率a，求出对应的目标麝香化合物浓度C实际；具体计算公式如下OR/a式中C——浓度(单位Hg/1)R——相对响应值，R=S目/S内a——相对应标准曲线的斜率为了保证消除背景干扰，根据上述公式，先计算出空白实验的浓度C空白，将C实际减去C空S的值，乘以样品定容的体积，再除以母乳脂肪恒重后所称得的重量，最终所得的结果就是母乳中合成麝香的浓度，艮P:C样品浓f(C实际一C空白)x定容的体积(ml)/脂肪重量(g)。空白实验即用蒸馏水代替前述母乳进行上述四个步骤的预处理过程。本发明中关于合成麝香标样的图谱参见图1。图1的质谱图中罗列了四种合成麝香的标准曲线图，包括有佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)、酮麝香(MK)、二甲苯麝香(MX)。本发明中关于基质加标中合成麝香物质的图谱参见图2。图2的质谱图是在基质母乳中人为地加入四种合成麝香ADBI、AHMI、HHCB、AHTN，并经前述四个步骤的预处理过程后所得的曲线图。图中的内标HMB为六甲基苯；D10-菲为回收率指示物。本发明中关于母乳样品中合成麝香的图谱参见图3。母乳样品为待测的实际母乳试样，在经过前述四个步骤的预处理过程后，测得的质谱曲线图。图3中右侧的小图是AHTN、MX、MK麝香的局部放大的曲线图。本发明中实施例的一个举例示出的AHTN标准曲线图参见图4。在图中，AHTN标准曲线，y=0.0017x，得知其斜率a=0.0017。母乳样品中麝香浓度的测定根据上述的计算公式，对10个母乳样品进行检测，得出的结果见下表l:表l10个母乳样品中合成麝香的浓度(单位ng/g脂肪)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注N.D——表示未检测出该物质据美国EPA规定回收率在80%-120%之间是正常的可以接受的范围，本发明母乳中的合成麝香的回收率均在此范围内，说明本实验方法是可靠的。浓度计算举例-在母乳样品6中，内标HMB响应值的峰面积为Sft=1106024，AHTN则为Ss=46105，则其相对响应值R=46105/1106024=0.0417,根据标准曲线R=0.0017x，得浓度C5=x=R/a=0.0417/0.0017=24.52|ag/l相对应该样品同批次的空白中，内标HMB响应值的峰面积为S空内=1539673，AHTN则为S空目=10482，则其相对响应值r=10482/1539673=0.0068,则浓度CM=x=r/a=0.0068/0,0017=4.00吗/1由于样品都定容到0.05ml，则浓度转化到相对应的脂肪重量为(母乳样品1中提取的脂肪恒重为0.0247g)，C样品浓度-(C实际一C空。)x定容的体积(ml)/脂肪重量(g)=(24.524)x0,05/0.0247=42ng/g(脂肪)，其余的目标化合物以相同的方式计算其浓度。权利要求1.一种测定母乳中合成麝香浓度的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤A、液液萃取和恒重脂肪量取5ml母乳样品放入分液漏斗中，加入0.01μg回收率指示物D10-菲，随后加入8ml8％的草酸钾和10ml乙醇充分摇匀，再加入5ml的乙醚振荡，将所述混合液进行液液萃取；先加入20ml正己烷，充分振荡，静置分层，待液面分层后，进行分液，取上层清液倒入鸡心瓶中，待用；将收集到的下层浑浊液再倒入分液漏斗中，加入10ml正己烷，充分振荡，静置分层，取上层清液倒入原待用的鸡心瓶中；下层浑浊液按上述同样方法逐级重复萃取三次，之后弃去下层浑浊液；将并和收集于原鸡心瓶中的澄清液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至体积2～3ml；然后转移至事先称重的棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，放于干燥器中恒重2天，将恒重的脂肪称量，记录下脂肪重量；B、上凝胶色谱柱(GPC柱)处理将上述恒重的脂肪用少量正己烷和二氯甲烷的混合液溶解，两者的体积比即正己烷∶二氯甲烷＝1∶1；然后过凝胶色谱柱(GPC柱)；该柱填料为Bio-BeadsS-X3凝胶，其作用是使母乳通过GPC柱而分离其中的脂肪，淋洗液为165ml的正己烷和二氯甲烷(v/v＝1∶1)的混合液，用量筒接取前65ml的淋洗液，弃去，然后用100ml的量筒接取剩余的100ml淋洗液，将该淋洗液转移至鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，待用；C、过硅胶小柱处理将上述待用的2ml溶液过硅胶小柱处理，该柱中主要装有一定高度的硅胶，其作用主要是去除溶液中的杂质；先加入15ml正己烷进行淋洗，弃去淋洗液，再加入30ml二氯甲烷进行淋洗，用量筒接取30ml淋洗液，转移至鸡心瓶中，将该淋洗液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，将溶液转移到棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，待用；D、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测在上述棕色小瓶中加入1μl10ppm六甲基苯作为内标，以及49μl的正己烷，进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测；色谱仪条件及质谱仪条件分别如下色谱条件DB-5(30m×0.25mmi.d.，0.25μm)或HP-5(30m×0.25mmi.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.0ml/min，无分流进样，进样量为1μl；进样口温度290℃；柱始温100℃(1min)，7℃/min升至160℃，3℃/min升至180℃，1℃/min升至190℃，10℃/min升至280℃，后运行300℃(5min)。质谱条件电子电离(EI)源；离子源温度200℃，界面温度280℃；选择性离子分段扫描(SIM)，六甲基苯的扫描离子为m/z147、162；佳乐麝香(HHCB)243、258、213；吐纳麝香(AHTN)243、258、201、159；酮麝香(MK)279、294；二甲苯麝香(MX)282、297；D10-菲188；溶剂切除时间8min；E、浓度计算a、绘制标准曲线分别用混标配制不同浓度的溶液；用四种目标合成麝香化合物，即佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)、酮麝香(MK)、二甲苯麝香(MX)四种目标化合物回收率指示物D10-菲，配制成浓度分别为10μg/l、20μg/l、40μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l、1000μg/l七个不同浓度的标准样品溶液；并加入浓度为100μg/l的内标六甲基苯；将上述标准样品溶液进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，测得各浓度点相应值；读出标准样品中这四个目标化合物的峰面积(S标目)以及内标化合物的峰面积(S标内)，将两者的比值，即相对响应值R＝S标目/S标内，并以R作为纵坐标，浓度C为横坐标，作为四个目标麝香化合物的标准曲线；b、浓度计算主要采用内标法进行计算；通过前述母乳液的气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的分离和分析，读出母乳液中各个目标化合物的峰面积(HHCB、AHTN、MK、MX)即S目，以及内标六甲基苯的峰面积即S内，S目与S内的比值即为响应值R，再根据对应的目标化合物的标准曲线的斜率a，求出对应的目标麝香化合物浓度C实际；具体计算公式如下C＝R/a式中C——浓度(单位μg/l)R——相对响应值，R＝S目/S内a——相对应标准曲线的斜率为了保证消除背景干扰，根据上述公式，先计算出空白实验的浓度C空白，将C实际减去C空白的值，乘以样品定容的体积，再除以母乳脂肪恒重后所称得的重量，所得的结果就是母乳中合成麝香的浓度，即C样品浓度＝(C实际-C空白)×定容的体积(ml)/脂肪重量(g)；空白实验即用纯净水代替前述母乳进行上述四个步骤的预处理过程。全文摘要本发明涉及一种可稳定检测母乳中合成麝香浓度的方法，通过凝胶色谱柱化学预处理方法以及气相色谱与质谱联用技术相结合的方法来达到测定母乳中合成麝香浓度的目的。本发明属有机化学物质的物理化学分析测定
技术领域：
。本发明方法中，母乳预处理过程包括液液萃取、过凝胶色谱柱，淋洗液浓缩后的溶液过硅胶小柱处理，最后进入色谱仪-质谱仪(GC-MS)进行检测，得到母乳试样中含有各种合成麝香的质谱曲线图，然后利用特定公式进行计算母乳中含有的麝香浓度。本发明方法是一种稳定的、较高精确度的有效测定方法。文档编号G01N30/88GK101334391SQ20081004062公开日2008年12月31日申请日期2008年7月16日优先权日2008年7月16日发明者静周,张晓岚,梁高锋,珺王,郭亚文申请人:上海大学