专利名称：检测ⅲ型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测登革病毒ns1抗原的酶联免疫试剂盒，以及这
种试剂盒对登革热作出早期分型诊断中的应用。
背景技术：
登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，通过埃及伊蚊和白蚊伊蚊传播，登
革病毒有4个血清型I型、II型、III型和IV型(简称dv1、 dv2、 dv3 和dv4)，任何型别的登革病毒感染均可引起一系列的临床症状，表现为 隐性感染、发热、登革热、或更为严重的登革出血热和登革休克综合征。 登革病毒主要流行于热带和亚热带地区，近100多个国家、25亿人口受 到威胁，在登革疫区中，多见4型登革病毒交替流行，更增加了不同型别 反复感染的危险性。登革热已成为一种严重危害人类健康的蚊媒病毒传染 病。初次感染登革病毒所获得的免疫力对于同型病毒的再次感染可产生终 身的免疫保护作用，但是对于其它型别登革病毒的再次感染仅能产生部分 而且短暂的免疫保护作用。由于存在抗体依赖的感染增强作用，异型登革 病毒再次感染是发生登革出血热/登革休克综合征的主要危险因素。
目前，具有保护性的登革病毒疫苗尚未研制成功，临床上对于登革病 毒的感染亦未有特异性的治疗措施。但研究表明及早的临床处理可以减少 dhf的发病率和致死率。由于多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床 表现，登革病毒感染确诊依赖于实验室诊断手段。目前，登革病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。由于4种登革病毒的血清型之间，以及与其它黄病毒成员间存在共同抗原表位，用传统的
血清学方法如血凝抑制试验、IgM和IgG抗体捕获ELISA法等检测时存在交叉反应，结果易出现假阳性，并且，血清学检测方法也不能用于早期诊断。病毒分离是登革病毒感染诊断的金标准，并可进一步用于病毒血清型的鉴定，但是该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。RT-PCR敏感性高，并且可以鉴定病毒血清型，但因技术要求高、样品易受污染且价格昂贵而使其应用受到限制。
登革病毒中的非结构蛋白1 (nonstructural protein 1 ,NS1)是一种重
要的高度保守的糖蛋白，其抗原性很强，且研究发现在登革热患者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此检测急性期病人血清中的循环NS1抗原可用于早期诊断登革病毒感染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有
高灵敏度和特异性的m型登革病毒NS1抗原的简便快捷的免疫诊断试剂
盒，直接从血液标本中检测出DV3NS1抗原，对登革热作出早期分型诊断。
为了解决以上技术问题，本发明提供的检测III型登革病毒的酶联免疫试剂盒，包括包被有特异性抗体1D14A2A10的微孔反应板和标记有生物素的检测抗体5D32A17。
其中，所述的单抗1D14A2A10和单抗5D32A17均属IgGl类免疫球蛋白，能与m型登革病毒的非结构蛋白1 (nonstructural protein 1 ,NS1)结合，其中单抗1D14A2A10由保藏号为cctcc—c200819的杂交瘤细胞株1D14A2A10分泌，单抗5D32A17由由保藏号为cctcc—c200820的杂交瘤细胞株5D32A17分泌。杂交瘤细胞株1D14A2A10和5D32A17是用重组的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞融合，最后用HAT筛选得到。标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，优选生物素。当本发明检测抗体上结合的标记物为生物素时，本发明试剂盒还
含有标记有辣根过氧化物酶的亲和素。亲和素能与生物素以1 : 4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提高敏感度。为了实际应用中更方便操作，所述试剂盒还包括浓縮洗液、阳性对照、阴性对照、显色液和终止液。
本发明的检测m型登革病毒nsi抗原的免疫诊断试剂盒可达成以下功效准确、快速地检测出ni型登革病毒，而与其它i型、n型和iv型登革病毒以及乙型脑炎病毒、黄热病毒无交叉反应，有利于对登革病毒感染作出早期分型诊断；此外，该试剂盒成本低，对样品处理过程要求简单，
能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液形式提供，检测方法简便易行；具有高灵敏度、高特异性的特点。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。图l是单抗1D14A2A10与DV1感染C6/36细胞抗原片反应结果。图2是单抗1D14A2A10与DV2感染C6/36细胞抗原片反应结果。图3是单抗lD14A2A10与DV3感染C6/36细胞抗原片反应结果。图4是单抗lD14A2A10与DV4感染C6/36细胞抗原片反应结果。图5是单抗5D32A17与DV1感染C6/36细胞抗原片反应结果。图6是单抗5D32A17与DV2感染C6/36细胞抗原片反应结果。图7是单抗5D32A17与DV3感染C6/36细胞抗原片反应结果。图8是单抗5D32A17与DV4感染C6/36细胞抗原片反应结果。图9是单抗1D14A2A10与5D32A17与DV3 NS1蛋白结合的免疫印迹结果。
图IO是检测III型登革病毒NSI抗原的免疫诊断试剂盒的特异性分析结果图。
具体实施例方式
本发明的检测原理是将1D14A2A10作为包被原吸附于微孔反应板上，加入处理后的待测样品后再依次加入标记有生物素的检测抗体5D32A17和标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素，显色后终止，测定样品吸光值，即可进行判断。
本发明是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所用的捕获抗体1D14A2A10是从一组抗III型登革病毒的NS1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，能特异性结合III型登革病毒的NS1蛋白；检测抗体5D32A17是一种与其它三型登革病毒具有交叉反应性的单抗，两者分别结合不同的抗原表位。本发明试剂盒可以实现准确、快速地检测出III型登革病毒，而
与其它i型、n型和iv型登革病毒以及乙型脑炎病毒、黄热病毒无交叉反应，有利于对登革病毒感染作出早期分型诊断。
本发明的杂交瘤细胞株1D14A2A10和杂交瘤细胞株5D32A17已于2008年4月28号在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，并收到保藏登记号为CCTCC—C200819和CCTCC_C200820。
下面将通过具体的例子和实验报告进一步阐明本发明的试剂盒1、单克隆抗体制备及鉴定
(1) 免疫原的制备
本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组DV3 NS1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组DV3 NS1蛋白是用携带DV3 NS1蛋白基因工程菌株为一种大肠杆菌菌株进行制备的，其制备按常规方法进行，经用高浓度变性剂反复洗涤纯化获得NS1抗原，详细的制备方法可参照使用手册。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE， Cat， No.ED62976)定量。Western blot对纯化的重组蛋白鉴定结果显示，重组NS1蛋白能与4型登革病毒交叉性单抗结合，在分子量约41KDa处出现特异性的反应条带，与预测的DV3 NS1分子量大小一致。已灭活天然的病毒抗原，是从DV3感染的病毒宿主细胞(C6/36， 一种白蛟伊蚊细胞)获得。
(2) 抗原免疫
取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积DV3NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30吗，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的DV3抗原或重组的DV3 NS1抗原交替免疫共6次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV3 NS1抗原100吗进行加强免疫，3天后取其脾细胞进行融合。
(3) 杂交瘤细胞制备及筛选饲养细胞的制备取正常BALB/C小鼠，眼球放血后，颈椎脱位法处
死，浸没入75%酒精中5min，超净工作台无菌操作取出小鼠脾脏，于铜网上研磨制成细胞悬液并用无血清1640 (含庆大霉素100pg/ml)洗涤二次，离心去上清，用40ml含15。/。FBS的1640培养液重悬细胞，平均分至96孔板中，约60pl/孔，37°C， 5MC02孵箱培养待用。
细胞融合取免疫血清效价较高的小鼠，眼球放血后，颈椎脱位法处死，浸没入75Q/。酒精中5min，超净工作台无菌操作取出小鼠脾脏，铜网研磨完全后，用无血清1640洗涤细胞二次后，将对数生长期的NS-1细胞与脾细胞按1:4比例混匀，室温1000rpm离心5 min，弃尽上清；在37°C水浴中，在1 min内缓慢加入1 ml PEG 1450，边加边轻轻摇匀；分别于1min、 2min、 3 min、 4min、 5min内力卩lml、 2ml、 3 ml、 4ml、 5 ml无血清1640终止融合；最后加入10 ml 15% FBS 1640培养基，室温800 rpm离心5min;弃上清，用60ml上述培养基重悬，平均分至加有饲养细胞的96孔板中，100pl/ L， 37°C， 5%0)2孵箱培养。次日对融合的细胞加入2xHAT选择培养基，以后每隔2天用lxHAT培养基换液一次。待融合细胞克隆长至占孔底面积的1/10时，取培养上清经间接ELISA法用NS1蛋白和DV3病毒进行双筛选。阳性克隆转至24孔培养板中扩大培养，经ELISA和免疫荧光(DV3感染细胞抗原片)复测仍为强阳性的克隆用有限稀释法进行克隆化。克隆化2 3次至阳性率达100%，选择分泌抗体效价高的细胞株扩增培养后置-8(TC保存。(4)单克隆抗体腹水制备和纯化
腹水制备采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞制备腹水。阳性杂交瘤细胞株置5%C02、 37"C培养箱中培养，取对数生长期的细胞，离心弃上清，用预冷的无血清RPMI 1640培养基重悬并洗涤细胞2次，以适量预冷的培养基重悬细胞计数，每只小鼠腹腔注射3xl06 5xl06个/20(Vl (小鼠于1周前腹腔注射不完全佐剂0.5 ml)。约1 2周后小鼠腹水形成，用7号注射针头收集腹水，离心后收集腹水上清，立即加入叠氮钠至终浓度为0.1%,存放于4。C备用。
单抗纯化用辛酸一硫酸铵沉淀法纯化腹水。操作方法如下将腹水于4°C ， 12 000 rpm离心30 min，加入2倍腹水体积的0.06M、 PH4.4乙酸钠缓冲液，在室温搅拌下30min内按33 pl/ml逐滴缓慢加入辛酸，4°C静置2小时，离心30分钟，取上清经定性滤纸过滤后，加入上清体积1/10体积的0.1MPBS，并用1MNaOH调PH值至7.4，冰浴搅拌下，缓慢加入固体硫酸铵0.277 g/ml(硫酸铵终浓度为45%), 4。C静置过夜，离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量的0.01MPBS， 4。C透析过夜，透析后的抗体用Bradford法测定抗体蛋白含量，4"C保存备用或加50%甘油冻存于-8(TC备用。
(5)单克隆抗体特性鉴定
免疫球蛋白亚类鉴定采用间接ELISA，包被纯化的DV3 NS1抗原，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与HRP标记羊抗小鼠IgM、IgGl、 IgG2a、 IgG2b和IgG3抗体反应，充分洗涤后TMB显色，测A450值。本专利发明的两株单克隆抗体均为IgGl。
单克隆抗体特异性鉴定采用间接ELISA法，分别用4型重组DVNS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。结果显示本专利发明的单克隆抗体1D14A2A10为DV3特异性单抗，而5D32A17为型交叉性单抗。另外，采用间接免疫荧光法，按常规方法培养I IV型登革病毒并制作感染细胞抗原片，分别与阳性杂交瘤细胞培养上清和FITC标记的羊抗小鼠IgG孵育，并设立未感染病毒的C6/36细胞抗原片作为阴性对照，对照图1-图8可知图1， 2， 4表明单抗1D14A2A10分别与DV1， DV2， DV4感染C6/36细胞抗原片均呈阴性反应，图3表明单抗1D14A2A10与DV3感染C6/36细胞抗原片呈阳性反应，图5-8表明单抗5D32A17分别与DV1 DV4感染C6/36细胞抗原片均呈阳性反应，说明荧光显微镜下观察结果与间接ELISA检测结果一致。在图9中M代表彩虹预染蛋白质分子量标准，其中带2为单抗1D14A2A10与DV3 NS1蛋白结合带，带5为单抗5D32A17与DV3 NS1蛋白结合带，免疫印迹结果显示两株单抗与重组DV3NS1蛋白均可在分子量约41KD处显示阳性结合带。
单克隆抗体竞争表位分析采用竞争抑制实验。纯化的NS1蛋白lpg/ml包被酶标板，先加入lmg/ml纯化的单抗50pl，再加入稀释的生物素标记单抗5(^1， 37。C孵育1 h后0.5%Tween 20的PBS洗板，加入lOOplHRP标记亲和素，26"孵育30min后洗板TMB显色，测定A450值。以单抗对同一生物素标记单抗的抑制为阳性对照，以己知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。抑制率计算公式为(1一各孔测定值/阴性对照值)xl00。抑制率>75%判定为表位相关，〉50%为不完全相关，<50%为不相关，<25%为完全不相关。结果显示2株单抗识别2个不完全相同的抗原位点。2、检测III型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒
(1) 所用试剂的配制
a. 辣根过氧化物酶标记的亲和素，购自Zymed公司；
b. 浓縮洗液含有2。/。Tween-20的20xPBS,即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4，58.02g Na2HP04.12H20,175.3g NaC1,15磅20min高压灭菌后,加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；
c. 阳性对照DV2NS1抗原1:1000稀释液；
d. 阴性对照含0.1。/。Tween-20的10mM PH7.4 PBS,即1L溶液中含有4.56gNaH2PO4,58.02gNa2HPO4.12H2O,175.3gNaC1,15磅20min高压灭菌,20倍稀释后加入0.1% Tween-20;
e. 显色液由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、 B的组成成分如下
显色液A :
将0.89g拧檬酸和0.16g EDTA 二钠溶于1000ml水中，115。C高压30min，降至90。C后加TMB0.25g，摇匀于4。C闭光保存；显色液B :
将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA 二钠溶于1000ml水中，115。C高压30min后，降至90。C后加0.75。/。过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4。C闭光保存；
f. 终止液1MH2S04。
(2) 酶标板的制备
将本发明单抗1D14A2A10用lOmM磷酸盐缓冲液(pH7.6)稀释至5吗/ml， 150W/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，4。C过夜。拍干后，每孔加 入300^1/孔的0.25。％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4。C过夜以封闭非特异性结合位点。倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封4i:保存。(3)生物素标记5D32A17的制备将2.2mg生物素溶解于0.5ml蒸馏水，取其3(^1加入到lml单抗 5D32A17 (浓度为2mg/ml)中，4。C静置2h后于PBS中4。C透析过夜， 换液三次。收集结合物加入终浓度50%甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲 液稀释1000倍，即为工作液。3、 检测血清样品中的m型登革病毒NSl抗原取待测的样品100pl，加入1D14A2A10包被的聚苯乙烯96孔微量测 试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37T:温育lh，浓縮洗涤液20倍稀 释后洗涤板条，洗板五次后，加入1:1000稀释的生物素标记的单抗 5D32A17， 100^1/孔，室温30min，同上洗板五次后，加入1:1000稀释的 辣根过氧化物酶标记的亲和素，100^1/孔，室温30min，同上洗板八次后 加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100^1/孔，室温避光10min 后，加入终止液，100^1/孔，终止反应。以空白孔调零，于450nm波长测 定吸光度(A值)。阳性对照平均值^).50，阴性对照平均值SO.IO，实验 成立。样品A值^阴性对照A值平均值x2.1，则判为阳性，反之为阴性。本节中所用试剂均按照2中的试剂配制方法进行配制。4、 检测III型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒的灵敏度及特异 性分析(1)灵敏度检测以纯化的梯度稀释DV3 NS1蛋白为标准检测品，以相应BSA为阴 性对照，进行双抗体夹心ELISA试验。以BSA的检测值作为标准，以 检测值大于或等于相同BSA浓度检测值的2.1倍的DV3 NS1的最低浓度 作为本方法检测该抗原的灵敏度。结果显示，抗体对检测重组DV3 NS1 蛋白的灵敏度约为0.4pg/ml。(2)特异性分析用梯度稀释的四个血清型登革病毒培养上清及乙脑病毒和黄热病毒 培养液进行检测，结果如图10显示，本发明试剂盒仅特异的检测DV3， 与其余3型DV病毒培养液无交叉反应，并且与其它黄病毒属的病毒如乙 脑病毒及黄热病毒均不发生交叉反应。说明建立的双抗体夹心抗原捕获 ELISA检测具有登革病毒血清型特异性。
权利要求
1、一种检测III型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，包括包被捕获抗体的微孔反应板和标记有标记物的检测抗体。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体是 由保藏号为CCTCC一C200819的杂交瘤细胞株1D14A2A10分泌的单克 隆抗体1D14A2A10，所述的检测抗体是由保藏号为CCTCC一C200820的 杂交瘤细胞株5D32A17分泌的单克隆抗体5D32A17。
3、 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的杂交瘤细胞 株1D14A2A10和5D32A17是用重组的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉 免疫小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞融合， 最后用HAT筛选得到。
4、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物是生 物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素。
5、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括浓縮 洗液、阳性对照、阴性对照、显色液和终止液。
全文摘要
本发明公开了一种检测III型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，以及这种试剂盒在检测III型登革病毒NS1抗原中的应用。本发明提供的检测III型登革病毒抗原的免疫诊断试剂盒，包括包被单抗1D14A2A10的微孔反应板和标记有生物素的单抗5D32A17，还可以包括阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性的检测III型登革病毒的NS1蛋白，与其他3种血清型登革病毒NS1无交叉反应，并且分别结合NS1不同抗原位点。本发明的检测III型登革病毒抗原的免疫诊断试剂盒能同时快速检测大批样品，具有高特异性、高敏感性等特点，能够快速、准确的对登革病毒感染病人进行早期分型诊断，具有重要的临床应用价值。
文档编号G01N33/543GK101576560SQ20081004334
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月8日 优先权日2008年5月8日
发明者晶 晋, 潘玉先, 车小燕 申请人:南方医科大学