专利名称：：一种检测Beta-2微球蛋白的化学发光免疫分析测定试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫分析Beta-2微球蛋白定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：Beta-2微球蛋白(日2-MG)，是Berggard于1968年率先由肾小管病变患者尿中分离出来的一种低分子量(丽11800)球蛋白，所有有核细胞均能产生，最主要由淋巴细胞产生，广泛存在于人的血浆，尿以及脑脊液等体液中和有核细胞膜表面，在正常情况下，细胞表面的Beta-2微球蛋白与体液中游离的Beta-2微球蛋白反复结合解离，维持一种动态的平衡状态，在某些病理状态下，比如肺'癌、肾癌、乳腺癌以及消化系统恶性肿瘤等，这种动态平衡会被打破，血液中游离的Beta-2微球蛋白水平异常升高，因此，近几年，Beta-2微球蛋白成为一种重要的肿瘤血清学诊断标志物而被广泛关注。目前Beta-2微球蛋白的临床诊断技术主要包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)等方法，但这些方法都存在不同程度的不足放射免疫是临床比较常用的方法，优点是结果比较准确，线性范围较宽，缺点是操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代。ELISA存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏度(检测限度可达10(-15)l0(-18)moL/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)，HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。基于荧光素与荧光素抗体之间存在特异性的高亲和力，使用模式一般有两种1、使用荧光素标记检测抗/原体，荧光素抗体标记酶，在双抗原或双抗体夹心的基础上进一步增强反应信号，该模式在生物学中逐渐被发展并应用，目前已经有商品化试剂可以得到，并且相关的标记程序也已基本固化，这些条件都大大便利了它的应用；2、将荧光素抗体包被固相，将荧光素标记捕获抗原/抗体，作为捕获抗体的间接包被方式，这种方式为一些不易直接固相化的抗原/抗体的固相化提供了可能，同时，由于荧光素与荧光素抗体的良好稳定性，也为一些直接固相化后性质不稳定的抗原/抗体扩大了应用范围，但该模式目前应用较少，发展空间很大。
发明内容本发明创造性的将化学发光免疫分析法与荧光素/荧光素抗体系统应用到Beta-2微球蛋白的定量检测中，既可以保留化学发光免疫分析法的高灵敏度，又可以利用荧光素/荧光素抗体系统的优势弥补Beta-2微球蛋白不易包被和包被后易失活的缺点。另外，现有的化学发光免疫分析试剂为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。本发明的目的是提供一种荧光素/荧光素抗体技术结合化学发光免疫分析法定量检测血中Beta-2微球蛋白的试剂盒，本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法
技术领域：
：本发明所述的化学发光免疫分析法定量检测血液中Beta-2微球蛋白的试剂盒包括1、包被荧光素抗体的固相载体2、荧光素标记的捕获抗体3、酶标记的检测抗体4、上述酶作用所需的发光底物5、Beta-2微球蛋白系列标准品，及6、浓縮洗涤液具体的，本发明的试剂盒制备过程包括A、固相载体的制备选用高纯度、高亲和力荧光素抗体，使用包被缓冲液稀释到一定浓度后，以一定的量包被固相载体，之后使用封闭液进行封闭，晾干，加入干燥剂后用铝箔袋密封即可。B、捕获抗体的荧光素标记选择高纯度高亲和力的Beta-2微球蛋白捕获抗体使用荧光素标记缓冲液透析后，加入一定量的高质量商品化荧光素试剂，反应一定时间后，再次使用荧光素标记缓冲液进行透析，加入等体积甘油，-20°C保存备用。C、检测抗体的酶标记选取高纯度高亲和力且与选定捕获抗体严格配对的Beta-2微球蛋白检测抗体，使用酶标缓冲液进行透析，加入一定量已活化的酶，避光反应一定时间后，使用饱和硫酸铵溶液沉淀，离心，将沉淀使用磷酸缓冲液复溶后，加入等体积甘油，-2(TC备用。D、荧光素标记捕获抗体与酶标检测抗体的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体使用酶稀释液按比例稀释后按照所需量分装即可。E、发光底物的制备基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、.4.9g硼砂，其pH值为8.010.0，配制好后按照所需量分装即可；基于lOOOmL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值为7.07.6，配制好后按照所需量分装即可。F、Beta-2微球蛋白系列标准品配制选用商品化高纯度Beta-2微球蛋白，使用国家标准品对照测定确定其浓度后，使用小牛血清进行系列稀释S6:8.0ug/ml，S5:4.0ug/ml，S4:2.0iig/ml，S3:1.0ug/ml，S2:0.5yg/ml，Sl:0.2ug/ml，SO:0小牛血清。G、浓縮洗涤液的配制基于lOOOmL所述浓缩洗涤液，包括4gNaH2P042H20、58gNa2HP0412H20、175.32gNaCl、10mlTween-20、lmlProclin-300，其pH值为7.0-7.6，配制好后按所需两分装即可。H、组装成成品试剂盒。其中，所述步骤A中，所用固相载体为96孔板或塑料管，所用包被缓冲液为pH9.6的碳酸缓冲液或pH7.2的磷酸盐缓冲液或pH4.7的柠檬酸缓冲液；浓度为1-5yg/ml;包被量为100-200U包被条件为4'C过夜或室温6小时；封闭量为150-250ul/孔；封闭条件为37'C2小时或室温4小时。优选的方案为96孔板，碳酸盐缓冲液稀释为2.5yg/ml,200u1/L，4'C过夜包被，250ul/孔37°C2小时封闭。所述步骤B中，荧光素标记用缓冲液为磷酸盐缓冲液或碳酸缓冲液，加入荧光素的量为15-50wg/mg抗体，反应时间为1-4小时，优选的方案为20mM117.2的磷酸缓冲液，加入荧光素与抗体的质量比30ug/mg，反应时间2小时，加入等体积甘油，-2(TC保存。所述步骤C中，选用的酶为碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)，标记缓冲液为磷酸缓冲液(AP)或碳酸缓冲液(HRP)，AP所用的偶联剂可以为碳二亚胺(EDC)或戊二醛，HRP所用的活化剂为高碘酸钠，优选的方案为改良高碘酸钠法HRP标记，标记后加入等体积甘油，-20°<:保存备用。、所属步骤D中，荧光素标记捕获抗体的稀释度可以是1:2,000-1:8,000，酶标记检测抗体的稀释度可以是1:5,000-1:20,000，所用的酶稀释液为20mMPBS，pH7.4，1-4%BSA，1-3%蔗糖，0.1-1.0%明胶，0.05-0.1%食品红，0.05-0.2%生物防腐剂。优选的，我们选用的荧光素标记捕获抗体的稀释度为1:5,000，酶标记检测抗体的稀释度为1:10,000，所用酶稀释液为20mMPBS，pH7.4，1.5%BSA，2.5%蔗糖，0.5%明胶，0.4%食品红，0.1%生物防腐剂，分装量为12ml/瓶。所属步骤E中，底物A液和底物B液的分装量均选择6ml/瓶。本发明的试剂盒具有化学发光免疫分析法的高灵敏度特性，又大幅度降低了成本，与国外的化学发光检测系统相比价格低廉且不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床Beta-2微球蛋白的检测提供了一种新的检测方法。本发明的试剂盒采用了荧光素/荧光素抗体系统，有效弥补了Beta-2微球蛋白不易包被和包被后易失活的缺点，从而降低了试剂盒规模化生产的难度，灵敏度高，特异性强，稳定性好，线性范围宽，实验成本低，可更有效地检测Beta-2微球蛋白。图1200份正常人血清测值统计结果图2与临床定值标本相关性比较结果具体实施例方式实施例一制备本发明的Beta-2微球蛋白化学发光定量免疫分析测定试剂本实施例的制备方法包括以下步骤1、固相微孔板的制备选用高纯度、高亲和力荧光素抗体，使用20mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释为2.5ug/ml，200ul/孔，4'C过夜包被，甩干液体，250ul/孔加入封闭液，37'C2小时封闭，甩干液体，室温静置24小时彻底干燥发光板，用铝铂袋封口包装，完成荧光素抗体包被的预包被发光板的制备。2、捕获抗体的荧光素标记选择高纯度高亲和力的Beta-2微球蛋白捕获抗体使用20mM磷酸缓冲液(pH7.4)4'C透析4小时后，按照30pg/mg的量加入高质量商品化荧光素试剂，反应2小时后，再次使用20mM磷酸缓冲液(pH7.4)进行4'C透析2小时，转入玻璃瓶中，加入等体积甘油，-20"保存备用。3、检测抗体的酶标记选取2ml浓度为2mg/ml的高纯度高亲和力且与选定捕获抗体严格配对的Beta-2微球蛋白检测抗体，使用2000ml酶标缓冲液进行4T:透析3小时，加入lmg己活化的酶，避光反应2小时后，使用饱和硫酸铵溶液沉淀，4X:离心30分钟，将沉淀使用10ml磷酸缓冲液复溶后，加入等体积甘油，-20°0备用。4、标记抗体液的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体分别使用酶稀释液按1:2500和1:5000的比例稀释后等体积混合，按照llml/瓶量分装即可。5、发光底物的制备基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.010.0，配制好后按照6ml/瓶的量分装即可；基于1000mL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值为7.07.6，配制好后按照6ml/瓶的量分装即可。6、Beta-2微球蛋白系列标准品配制选用商品化高纯度Beta-2微球蛋白，使用国家标准品对照测定确定其浓度后，使用小牛血清进行系列稀释S6:8.0ug/ml，S5:4.0Pg/ml，S4:2.0ug/ml，S3:1.0ug/ml,S2:0.5ug/ml，Sl:0.2ug/ml，SO:0小牛血清，0.5ml/瓶分装即可。7、浓縮洗涤液的配制基于1000mL所述浓縮洗涤液，包括4gNaH2P04'2H20、58gNa2HP0412H20、175.32gNaCl、10mlTween-20、lmlProclin-300，其pH值为7.0-7.6，配制好后按所需两分装即可。8、以每个试剂盒一块包被板，一瓶标记抗体液，发光底物A液、B液各一瓶，浓縮洗涤液一瓶，标准品一套，说明书一份，封板膜一张的要求将上述各组分组装成试剂盒。实施例二除了标记抗体液的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体分别使用酶稀释液按1:2000和1:5000的比例稀释后等体积混合。其他步骤同实施例一。实施例三除了标记抗体液的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体分别使用酶稀释液按1:2000和l:20000的比例稀释后等体积混合。其他步骤同实施例一。实施例四除了标记抗体液的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体分别使用酶稀释液按1:8000和1:5000的比例稀释后等体积混合。其他步骤同实施例一。实施例五除了标记抗体液的混合试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体分别使用酶稀释液按1:8000和l:20000的比例稀释后等体积混合。其他步骤同实施例一。实施例六本发明的试剂盒的使用方法1、加样从包装盒中取出各个组分，室温平衡30分钟，撕开铝箔带包装，将包被板置于平整桌面上，用微量移液器依次吸取25n1标准品各点或各样本血清加入包被板上各孔内，再以100ul/孔的量加入标记抗体液，振荡混匀，置37'C水浴反应1小时。2、洗涤以20mmolPBS，pH7.2，0.05%Tween-20的缓冲液洗涤包被板五遍后，拍干。3、加底物取5ml底物A液和5ml底物B液，混匀后立即迅速加入包被板各孔内，振荡混匀后，室温避光反应5分钟。4、测量将包被板置于化学发光测量仪内进行测量，读数，以标准品浓度及测量值绘制标准曲线，将各样本测量值代入标准曲线，计算各样本试剂浓度。实施例七本发明的实际盒检测临床标本的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1:正常人血清样品200份测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1.一种化学发光免疫分析法定量检测血液中Beta-2微球蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)预包被的通用固相载体；2)荧光素标记的捕获抗体；3)酶标记的检测抗体；4)上述酶作用所需的发光底物；以及5)Beta-2微球蛋白系列标准品。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的预包被物为荧光素抗体；所述的固相载体为微孔板和塑料管；所述酶为辣根过氧化物酶。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物的发光剂为鲁米诺、异鲁米诺。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，基于lOOOmL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.010.0;基于1000mL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值为7.07,6。5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)制备通用固相载体；2)标记捕获抗体的荧光素；3)检测抗体的酶标记；4)荧光素标记捕获抗体与酶标检测抗体的混合及分装；5)发光底物的制备及分装；6)Beta-2微球蛋白系列标准品配制及分装；7)组装成成品试剂盒。6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤l)中，通用固相载体的制备方法是选用高纯度、高亲和力荧光素抗体，使用包被缓冲液稀释到一定浓度后，以一定的量包被固相载体，之后使用封闭液进行封闭，晾干，加入干燥剂后用铝箔袋真空密封即可。7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中，捕获抗体的荧光素标记方法是选择高纯度高亲和力的Beta-2微球蛋白捕获抗体使用荧光素标记缓冲液透析后，加入一定量的高质量商品化荧光素试剂，反应一定时间后，再次使用荧光素标记缓冲液进行透析，加入等体积甘油，-20°(:保存备用。8、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中，检测抗体的酶标记方法是选取高纯度高亲和力且与选定捕获抗体严格配对的Beta-2微球蛋白检测抗体，使用酶标缓冲液进行透析，加入一定量已活化的酶，避光反应一定时间后，使用饱和硫酸铵溶液沉淀，离心，将沉淀使用磷酸缓冲液复溶后，加入等体积甘油，-20'0备用。9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中，荧光素标记捕获抗体与酶标检测抗体的混合及分装方法是试剂盒组装前将荧光素标记好的捕获抗体和酶标记好的检测抗体使用酶稀释液按比例稀释后按照所需量分装即可。10、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤5)中，发光底物的制备方法是基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.010.0,配制好后按照所需量分装即可；基于1000mL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04'12H20、8.74gNaH2P04'2H20，其pH值为7.07.6，配制好后按照所需量分装即可。11、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤6)中，Beta-2微球蛋白系列标准品配制选用商品化高纯度Beta-2微球蛋白，使用国家标准品对照测定确定其浓度后，使用小牛血清进行系列稀释S6:8.0yg/ml,S5:4.0ng/ml，S4:2.0ug/ml，S3:1.0"g/ml，S2:0.5ug/ml，SI:0.2ug/ml，SO:0小牛血清。全文摘要本发明公开了一种化学发光免疫分析法定量检测血液中Beta-2微球蛋白的试剂盒及其制备方法。本发明所述的化学发光免疫分析法Beta-2微球蛋白定量试剂盒包括包被荧光素抗体的固相载体；荧光素标记的捕获抗体和酶标记的检测抗体混合物；上述酶作用所需的发光底物，及Beta-2微球蛋白系列标准品。本发明的试剂盒既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。文档编号G01N33/68GK101368970SQ200810105419公开日2009年2月18日申请日期2008年4月29日优先权日2008年4月29日发明者于尚永,姚洪涛,宋胜利,应希堂,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司