专利名称：：一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定细菌产酶诱导物的方法。技术背景纤维素酶是多酶体系，受着复杂的代谢调控。酶产量及酶的比活力低一直是影响纤维素酶实际应用的一个重要原因，阐明纤维素酶诱导形成的机制和调节控制的原理，不仅有着理论上的意义，而且将为改变培养条件提高纤维素酶产量，设计筛选模型选育高产菌种提供新的线索和手段。过去人们对纤维素酶的诱导调节机制的研究多集中于木霉(rn'c/20&rmfl)等少数真菌菌株，有关细菌产生纤维素酶的机制了解得非常少。在真菌纤维素酶的研究中，虽发现了几种可诱导菌体产生纤维素酶的诱导物，但难以用真菌的诱导机理来解释细菌的诱导现象。因为，一方面目前人们对什么是纤维素酶合成的真正诱导物仍然存有争议，在以往所报道的文献中出现了很多有关何种物质是诱导物的报道；另一方面不能够确定胞外可诱导产酶的碳源在进入到细胞后，是否被胞壁酶或胞内酶转化为其它物质而起诱导作用或胞外诱导物不经任何转化而直接进入胞内起诱导作用。目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法。
发明内容本发明是为了解决目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，而提供一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法。本发明测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用在待测细菌的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5%，用4mL无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平行接入装有30mL发酵培养基的两个150mL三角瓶中，在30。C的条件下，以170r/min的速度进行振荡培养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离心15min，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及(3-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在3(TC的条件下，以170r/min的速度振荡培养10h，按l。/。的体积比接入装有200mL增菌培养基的三角瓶中，在30'C的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末期，以1000r/min的速度离心10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入10mL、pH值为7,2的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约2~3mm，调节超声振荡器的输出功率为500W，工作30s，停30s，循环30次，再以1000r/min的速度离心10min，然后以20000r/min的速度离心20min，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于4'C透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为0.02%;四、各酶制备物与底物的反应用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1:1的体积比混合，将反应混合物放入37"C水浴反应24h，然后在(TC的条件下以16000r/min的速度离心30min，收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件色谱柱为HighPerformanceCarbohydrateColumn(高效糖柱)4.6x250mm，流动相为的乙腈与按照75:25的体积比混合的混合液，流速为1.4mL/min，检测器为示差折光检测器，上样量为15pL，每个样品平行操作三次；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。本发明测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法的原理为步骤一为测定单位湿菌体的产酶量，产酶量的测定是为了初步确定胞外可诱导菌体产纤维素酶的碳源；步骤三为制备细菌胞内酶和胞膜酶，其作用是确定在胞外可诱导产酶的碳源在进入到细胞后，是否被胞壁酶或胞内酶转化为其它物质而起诱导作用或胞外诱导物不经任何转化而直接进入胞内起诱导作用；步骤四和步骤五为高效液相色谱的测定，高效液相色谱的测定是为了对胞膜酶和胞内酶作用于胞外诱导物后的产物进行定性分析，以确定菌体胞内产酶的真正碳源诱导物。本发明测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法具有步骤少、操作简单、用时短、费用低廉、无需昂贵的实验材料和特殊仪器的优点，本发明的方法可明确细菌胞内产纤维素酶的胞内碳源诱导物，这是从分子水平上全面弄清细菌产纤维素酶诱导机制的必不可少的前期步骤，用本发明的方法测定出细菌产纤维素酶的直接诱导物用以提高酶的产量。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用在待测细菌的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5%，用4mL无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平行接入装有30mL发酵培养基的两个150mL三角瓶中，在30。C的条件下，以170r/min的速度进行振荡培养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离心15min，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及l3-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在30°C的条件下，以170r/min的速度振荡培养10h，按1%的体积比接入装有200mL增菌培养基的三角瓶中，在30。C的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末期，以1000r/min的速度离心10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入10mL、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约23mm，调节超声振荡器的输出功率为500W，工作30s，停30s，循环30次，再以1000r/min的速度离心10min，然后以20000r/min的速度离心20min，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于4。C透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为0.02%;四、各酶制备物与底物的反应用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1:1的体积比混合，将反应混合物放入37'C水浴反应24h，然后在0-C的条件下以16000r/min的速度离心30min,收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件色谱柱为HighPerformanceCarbohydrateColumn(高效糖柱)4.6x250mm，流动相为的乙腈与按照75:25的体积比混合的混合液，流速为1.4mL/min，检测器为示差折光检测器，上样量为15jiL，每个样品平行操作三次；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。本实施方式中的标准品为各种单糖纯品(标准品的纯度为分析纯)。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点为步骤一的待测细菌为产纤维素酶的细菌，包括芽胞杆菌、纤维弧菌、纤维单胞菌、镰状纤维菌、噬纤维菌、生胞噬纤维菌、多囊菌、假单胞菌、热纤维端胞菌和热纤维梭菌。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式中不同菌种测定的诱导物相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点为步骤一中的碳源为CMC(羧甲基纤维素)、微晶纤维素、滤纸、棉花、sigmacell(购于Sigma公司的微晶纤维素粉)、葡萄糖、纤维二糖、果糖、麦芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、可溶性淀粉、蔗糖、棉子糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的一种或几种的组合。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式中碳源为两种或两种以上物质的混合物时，各种碳源的体积浓度相同。用本实施方式的方法分别测定以下两株芽胞杆菌(5""7/msp.X10-l-2和5a"7/wsp.X18)的产纤维素酶的胞内真正诱导物，测定数据如表l、表2、图1和图2所示。表1为X10-l-2和X18的不同碳源诱导酶活(单位为U/mL.g湿菌体)，表1的数据能够看出葡萄糖、纤维二糖、果糖、麦芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖均可在胞外诱导这两株菌产纤维素酶；表2为各样品的HPLC保留时间(单位为min)，表2的数据说明小分子物质经胞壁(膜)酶和胞内酶的作用后，所显示出的保留时间与标准品的保留时间相一致，说明两株芽胞杆菌的胞壁(膜)酶和胞内酶均未对这些可诱导菌体产纤维素酶的糖起到任何转化作用，由此可以认为，这些在胞外可诱导菌体产纤维素酶的物质是直接进入菌体内部起诱导作用的，可见，细菌的诱导产酶机制与真菌相比有较大的不同；表1和表2说明本实施方式的方法适用于研究细菌产生纤维素酶诱导物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>山梨醇nd0.3ndndndnd0.3ndndnd木糖醇ndndiidndndnd0.3ndndnd1)A:CMC;B:微晶纤维素；C:滤纸D:棉花；E:sigmacdl;F:葡萄糖；G:纤维二糖2)nd:未检测到3)注表中数据为平行操作的平均值表2糖标准物ISEA:X10-l-2胞内酶作用于糖后的产物；B:X10-l-2胞壁(膜)酶作用于糖后的产物；C:X18胞内酶作用于糖后的产物；D:X18胞壁(膜)酶作用于糖后的产物。鼠李糖3.483.50木糖4.074.07阿拉伯糖4.484.51山梨糖《854.874.904.955.385.435.735.776.116.17纤维二糖9.769.78麦芽糖9.979.95乳糖11.1211.123.503.503.504.084.074.084.514.494.494.864.844.844.934.934.915.395.385.385.735.735.716.116.106.109.789.749.749.959.959.9511.1211.1211.12fes.巨口..巨口,露银乳芽甘葡半权利要求1、一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，其特征在于测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用在待测细菌的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5％，用4mL无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平行接入装有30mL发酵培养基的两个150mL三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min的速度进行振荡培养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离心15min，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及β-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min的速度振荡培养10h，按1％的体积比接入装有200mL增菌培养基的三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末期，以1000r/min的速度离心10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入10mL、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约2～3mm，调节超声振荡器的输出功率为500W，工作30s，停30s，循环30次，再以1000r/min的速度离心10min，然后以20000r/min的速度离心20min，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于4℃透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为0.02％；四、各酶制备物与底物的反应用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1∶1的体积比混合，将反应混合物放入37℃水浴反应24h，然后在0℃的条件下以16000r/min的速度离心30min，收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件色谱柱为HighPerformanceCarbohydrateColumn4.6×250mm，流动相为的乙腈与按照75∶25的体积比混合的混合液，流速为1.4mL/min，检测器为示差折光检测器，上样量为15μL，每个样品平行操作三次；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。2、根据权利要求所述的一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，其特征在于步骤一的待测细菌为产纤维素酶的细菌，包括芽孢杆菌、纤维弧菌、纤维单胞菌、镰状纤维菌、噬纤维菌、生胞噬纤维菌、多囊菌、假单胞菌、热纤维端胞菌和热纤维梭菌。3、根据权利要求1所述的一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，其特征在于步骤一中的碳源为CMC、微晶纤维素、滤纸、棉花、sigmacell、葡萄糖、纤维二糖、果糖、麦芽糖、山梨糖、乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、可溶性淀粉、蔗糖、棉子糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的一种或几种的混合物。全文摘要一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，它涉及了一种测定细菌产酶诱导物的方法。本发明解决了目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法。本发明测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备；四、各酶制备物与底物的反应；五、高效液相色谱；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。本发明的方法可明确细菌胞内产纤维素酶的胞内碳源诱导物。文档编号G01N30/02GK101398415SQ20081013748公开日2009年4月1日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者谦杨,红燕申请人:哈尔滨工业大学