专利名称：磁性多孔化学电极的制备方法
技术领域：
本发明属于生物传感器制备技术领域，特别涉及一种磁性多孔化学电极的制 备方法。
二背景技术：
现有技术电化学生物传感器是一类将生物大分子之间的特异性结合直接或 间接地转化为可检测电信号的传感器。碳糊电极的研究始于20世纪八十年代， 并一度引起人们的高度关注，因为其制作方法特别简单而成本特别低廉，被认为 是制备和使用一次性电极的理想方法。但随着研究的不断深入，人们也发现此类 电极存在着结果重现性差和不宜长期保存的缺点，妨碍了在生物分析中的实际应 用。究其原因，可能主要有(l)电极制备的每一个过程并非完全重复和定量进 行，而且电极表面性质(比表面积、吸附活性位点多少等)也不高度一致；(2)粘 接剂(石蜡油等)的挥发干沽导致电极体相不严实而失效。传统碳糊电极结果重 现性差和不宜长期保存的缺点，上述缺点妨碍了在分析中的实际应用。虽然对电 极进行各种改性与修饰的报道不少，例如采用环氧树脂或导电胶等作为粘接剂， 得到的电极体相性质整体优于石蜡油作为粘接剂获得的结果，但并不能从根本上 解决存在的问题。
三
发明内容
技术问题本发明针对上述技术缺陷，提供利用结合功能化的纳米磁性颗 粒，制备"磁性多孔类碳糊电极"的方法，此电极不仅具有"多孔类碳糊电极"的特 性，还具有磁性材料的高效富集性能，可以迅速捕获溶液中通过磁性纳米颗粒富 集的靶标物质，然后测定电极上的电化学行为，可以快速有效高灵敏高选择性地 检测出靶标物质。
技术方案本发明的技术解决方案为 一种磁性多孔化学电极的制备方法， 制备步骤为将中空玻璃管洗净，将聚合物前躯体、石墨粉填料、磁粉与微球模 板以质量比1-5: 1-6: 1-8: 1-10充分均匀混合调成糊状，然后将所得碳糊混合物
3填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线，将电极在室温下浸泡在铁离子浓 度为0.1mol/L~ 1.5mol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内的糊状混合物发生 整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模板，得到磁性多孔 化学电极。
所述前躯体、填料、磁粉与微球模板的质量比为2: 2: 1: 3。微球模板含量 过低，抽提后电极表面孔较少，比表面不够大，微球模板含量过高，抽提后电极 表面的孔径很不均匀，容易出现大块空洞；磁粉含量过少，电极磁性较弱，不能 有效的富集磁珠，磁粉含量过高，电极的导电性能和比表面均会减小。
所述聚合物前躯体为吡咯、谨:吩或苯胺以及吡咯的书f生物(2-吡咯曱醛和吡 咯-2-羧酸)。
所述引发剂中所含铁离子为Fe"。
所述引发剂为三氯化铁或硫酸铁。
所述微球模板为粒径为2 ~ 5pm聚曱基丙烯酸曱酯微Jl^莫板，抽提剂为甲苯或 丙酮。
所述微球模板为粒径为2 ~ 5pm碳酸钙微球模板，抽提剂为稀盐酸。 所述去除微球模板时抽提剂的温度为2°C 37°C 。
一、 磁性多孔化学电极的制备
(1) 导电聚合物在聚甲基丙烯酸曱酯(PMMA)微球模板下的一体化聚合 将优化配比的前驱体、PMMA微球、磁粉和填料的混合物填入一定内径的玻
璃管内，插入金属导线，然后浸泡在含有引发剂的溶液中，使填充在玻璃管内的 混合物整体聚合。
(2) 聚合后PMMA微球模板抽提
整体聚合完成后，需要PMMA微球模板抽提干净，同时在抽提完模板剂后 还应使电极保持完好的整体多孔结构。
二、 磁性纳米Fe304颗粒的制备以及功能化
(1) 磁性纳米Fe304颗粒的制备
采用化学共沉淀法制备磁性四氧化三铁纳米颗粒。其原理是将二价铁盐和三 价铁盐溶液按一定比例混合，将碱性溶液快速加入至上述铁盐混合溶液中，搅 拌、反应一段时间即得纳米磁性Fe304粒子，粒径控制在25±5nm左右的球形 Fe304磁性颗粒。
(2) 磁性纳米Fe304颗粒功能化通过自组装技术对纳米磁性Fe304粒子进行链亲合素修饰、氨基修饰、醛基 修饰及包金。功能化后的磁性纳米Fe304粒子可以与DNA、抗原、抗体以及生物 大分子结合。通过磁场的作用，将它们固定在电极的表面。 三、多孔化学电极的应用
本发明有着广泛的应用，例如在生物传感方面，4姿;险测目标物生物大分子的性 质分类，主要可分为DNA 4全测、蛋白质检测、细胞^r测或组织、血液中其它成 分(如氨基酸、糖、代谢产物等)。本发明也可广泛应用于它他非生物大分子检 测。
有益效果由本发明制得的电极体相比表面积大，当电极体相比表面积足够 大时，更新截面或不同电极间表面性质的差异就不足以影响分析结果的平行可靠 性；另一方面，尽管使用如环氧树脂或导电胶等有可能部分改善碳糊电极的长效 性，但粘接剂的使用会堵塞一些孔道，影响不同界面或不同电极间孔性质的一致 性。为此，本发明提出磁性多孔化学电极的直接模板诱导合成，显著提高相应电 化学传感器的灵敏度，同时显著改善其保存长效性和分析结果的平行可靠性，并 获得好的选择性。该磁性多孔类碳糊电极具有如下优点:(l)整个电极是一个连续 的整体，不含粘接剂而可以避免粘接剂带来的诸多问题；(2)该电极具有磁性，对 纳米磁性颗粒修饰的DNA或抗原、抗体的吸附有很好的选择性；(3)该电极与传统 的磁性碳糊电极相比，比表面积大大提高，避免了普通磁性石友糊电极在富集时， 表面的大部分位点被一些没有结合上DNA或抗原、抗体的磁性颗粒占据而使结合 上DNA或抗原、抗体的磁性颗粒不易达到电极的表面进而不可避免地降低检测灵 敏度的缺点。因此，该电极有获得显著提高的灵敏度，而且具有显著改善的保存 长效性和分析结果的平行可靠性，以及好的选择性，有利于DNA或抗原、抗体以 及生物大分子的吸附、固定，提高检测灵敏度。本发明工艺简单，成本低廉，电 极灵敏度高，便于保存。
对本发明制得的磁性多孔化学电极进行了实验，在相同的条件下，乾DNA浓 度为100證ol/L,正配DNA分别为2謹ol/L 、 5nmol/L 、 1 Onmol/L 、 15nmol/L和 20nmol/L时，经过磁性电极的富集和金标4艮染后，采用阳极溶出法比较普通磁性 碳糊电极(石墨粉磁粉石蜡油=60: 20: 20 )和磁性多孔化学电极的电化学 检测信号，实验如图2所示，结果表明两种电极的伏安曲线均可以得到明显的 银的阳极溶出峰，而且，本发明所得的电极上的阳极溶出峰在不同的浓度时，峰 电流比普通的磁性碳糊电极的峰化峰电流要大，峰值提高了近25%。这是因为与 普通磁性碳糊电极相比，本发明所得的电极由于为孔状结构大大增大了电极的比 表面积，大大增加了DNA的富集和固定量，避免了普通磁性碳糊电极在富集时，表面的大部分位点被一些没有结合上DNA的磁性颗粒占据，大大提高了电极的富 集能力、选择能力以及检测的灵敏度。
本发明避免了使用粘接剂，避免了粘接剂(石蜡油等)的挥发干枯导致电极 体相不严实而失效，而且大大增大了电极的比表面积，大大提高了电极的灵敏 度。另外，本发明制备工艺简单、成本低、耗材少，而且具有好的保存长效性、 分析结果的平行可靠性以及选择性。
四
图1磁性多孔电极电化学检测DNA的流程图2磁性多孔电极与普通磁性碳糊电极检测DNA电化学信号的比较; 图3磁性多孔电极检测杂交DNA的浓度范围。
五具体实施例方式
实施例1:
(1) 微米碳酸钩的制备
本实验以电石渣为原材料，制备球形微米级碳酸4丐颗粒，具体方法如下1) 称取IOO g的电石渣，将其倒入2500 ml的烧杯中，再在烧杯中加入2000 ml的 水，搅拌直至充分溶解；2)在溶液中加入400 g的NH4C1，充分反应后，过滤除 去杂质；3)向溶液中加入一定量的氨水，调至pH值为ll; 4)将C02气体通入 溶液中，直到pH值为7.5时，反应结束；5)将上述溶液抽虑、烘干，得到 CaC03微球。
(2) 磁性纳米Fe304颗粒(磁粉)的制备
将0.2mol/L FeCl3'6H20水溶液与O.lmol/L FeCl2.4H20水溶液各lOOmL混合 均匀，并加入12.1mol/L HC1水溶液0.85 mL，在搅拌速度为1200r/min, T=60°C 下，匀速滴加(1滴/秒)到含有1.5 mol/L NaOH溶液250 mL的三颈烧瓶中。滴 加完成后，保持温度继续搅拌30分钟，最后冷却到室温。所有实验反应在N2的 保护下进行。反应结束后，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，并 先后用去离子水清洗3次，乙醇清洗2次，最后将Fe304纳米颗粒介敎到去离子 水中。
(3) 磁性多孔类碳糊电极制备
以内径为4 mm的中空玻璃管为例，将其洗净，烘干备用。将吡咯、石墨 粉、磁粉与PMMA (聚曱基丙烯酸曱酯)微球三者以质量比例为2: 2: 1: 3， 充分均匀混合调成糊状，然后将所得^f友糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线。再将填有碳糊混合物的玻璃管浸入0.2mol/L FeCl3的溶液中，在 室温下浸泡4小时使吡咯充分聚合，用水冲洗干净，烘干，再将电极浸入曱苯溶 液中浸泡，抽提除去PMMA微球模板即可得到多孔"类碳糊电极"。 (4)所制备的磁性多孔电极对DNA检测的实际应用效果
将100吗Fe304/Au磁性纳米颗粒加入0.5 ml的离心管中，经过Tris - HC1 緩冲液(pH =8.0)洗涤，磁性分离后，将Fe304/Au磁性纳米颗粒加入100 nl浓 度为0.1 pimol/L巯基探针(革巴DNA: 5' -SH-AAgCCAATCCACgCACgA-3')和 1 pmol/L巯基乙醇的Tris-HCl緩冲液(pH =8.0)中，充分反应3 h，磁性分 离，得到修饰有靶DNA探针和巯基乙醇(6-Mercapto-l-hexano1)的磁珠，将磁 珠经过Tris - HC1緩沖液(pH =8.0 )洗涤，磁性分离，将磁珠分散到100 pl浓度 为l mmol/L的琉基乙醇溶液中，充分反应30 min,对Fe304/Au纳米磁珠进行完 全封闭，将磁珠经过Tris - HC1緩沖液(pH=8.0)洗涤，磁性分离，将磁珠分散 到100 pi含不同浓度DNA探针(S1: 5' -BIO-(T)15TCgTgCgTggATTggCTT-3') 的杂交液中(750 mmol/L氯化钠，75 mmol/L柠檬酸钠)，在室温下杂交8h,磁 性分离，将杂交后的磁珠用Tris-HC1緩沖液(pH=8.0)洗涤两次，将磁珠分散 到100 pl浓度为10 pmol/L胶体金标记的链亲合素(Streptavidin 10 nm colloidal gold labeled)的Tris - HC1緩冲液(pH =8.0)中，在室温下反应2 h, 磁性分 离，将磁珠经过Tris - HC1緩冲液(pH =8.0)洗涤，磁性分离，将磁珠分散到装 有1.0 ml灭菌水的离心管中，将磁性多孔"类碳糊电极"浸入水中进行磁性富集 15 min,用去离子水洗涤两次，吹干，接着将富集了磁珠的多孔电极浸入银染溶 液中(4艮染显色液1.0 x lO-5 mol/L的AgN03和2.0 x l(T4 mol/L对苯二酚，温 度25°C,时间12 min),用去离子水冲洗，吹干，最后以磁性多孔电极为工作 电极，饱和甘汞为参比电极和铂电极为辅助电极，在0.10 mol/L HNO3+0.10 mol/L KN03的溶液中，于0.10 ~ 0.40 V间进行阳极溶出伏安扫描。
实施例2:
将中空玻璃管洗净，将聚合物前躯体、石墨粉、磁粉(磁性锶铁氧体，购于 湖南长沙升华科研所)与微球模板以质量比1: 1: 1: 1充分均匀混合调成糊 状，然后将所得碳糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线，将电 极在室温下浸泡在含铁离子浓度为O.lmol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内 的糊状混合物发生整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模 板，得到磁性多孔化学电极。所述聚合物前躯体为吡咯。所述引发剂为三氯化
7铁。所述微球模板为粒径为2~5pm聚曱基丙烯酸曱酯微球模板，抽提剂为曱苯 所述去除微球模板时抽提剂的温度为2°C 37°C。
实施例3:
将中空玻璃管洗净，将聚合物前躯体、石墨粉、磁粉(磁性锶铁氧体，购于 湖南长沙升华科研所)与微球模板以质量比5: 6: 8:10充分均匀混合调成糊 状，然后将所得碳糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一4艮铜导线，将电 极在室温下浸泡在含铁离子浓度为1.5mol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内 的糊状混合物发生整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模 板，得到磁性多孔化学电极。所述微球模板为粒径为2~5^m碳酸4丐微球模板， 抽提剂为稀盐酸。所述聚合物前躯体为噻吩。所述引发剂为硫酸铁。
实施例4:
将中空玻璃管洗净，将聚合物前躯体、石墨粉、磁粉(磁性锶铁氧体，购于 湖南长沙升华科研所)与微球模板以质量比2: 2: 1: 3充分均匀混合调成糊 状，然后将所得碳糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线，将电 极在室温下浸泡在含铁离子浓度为lmol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内的 糊状混合物发生整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模 板，得到磁性多孔化学电极。所述微球模板为粒径为2~5pm聚曱基丙烯酸曱酯 微球模板，抽提剂为丙酮。所述聚合物前躯体为苯胺。所述引发剂为FeCl3。
权利要求
1.一种磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于制备步骤为将中空玻璃管洗净，将聚合物前躯体、石墨粉填料、磁粉与微球模板以质量比1-5∶1-6∶1-8∶1-10充分均匀混合调成糊状，然后将所得碳糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线，将电极在室温下浸泡在铁离子浓度为0.1mol/L～1.5mol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内的糊状混合物发生整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模板，得到磁性多孔化学电极。
2. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述聚合物 前躯体、石墨粉填料、磁粉与微球模板的质量比为2: 2: 1: 3。
3. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述聚合物 前躯体为吡咯、噻吩、苯胺、2-吡咯曱醛或吡咯-2-羧酸。
4. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述引发剂 含Fe3+。
5. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述引发剂 为三氯化铁或硫酸铁。
6. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述微球模 板为粒径为2 ~ 5prn聚曱基丙烯酸甲酯微^M莫板，抽提剂为曱苯或丙酮。
7. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述微球模 板为粒径为2 ~ 5pm碳酸钙微球模板，抽提剂为稀盐酸。
8. 根据权利要求l所述的磁性多孔化学电极的制备方法，其特征在于所述去除微 球模板时抽提剂的温度为2。C 37°C 。
全文摘要
一种磁性多孔化学电极的制备方法，制备步骤为将中空玻璃管洗净，将前躯体、填料、磁粉与微球模板以质量比1-5∶1-6∶1-8∶1-10充分均匀混合调成糊状，然后将所得碳糊混合物填入玻璃管内，压实，管中央插入一根铜导线，将电极在室温下浸泡在铁离子浓度为0.1mol/L～1.5mol/L的引发剂溶液中，使填充在玻璃管内的糊状混合物发生整体聚合，最后，将电极放入搅拌的抽提剂中抽提除去微球模板，得到磁性多孔化学电极。本发明有着广泛的应用，例如在生物传感方面，按检测目标物生物大分子的性质分类，主要可分为DNA检测、蛋白质检测、细胞检测或组织、血液中其它成分(如氨基酸、糖、代谢产物等)。本发明也可广泛应用于它他非生物大分子检测。
文档编号G01N33/68GK101581689SQ200910033170
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者何农跃, 李智洋, 杜晶晶, 许利剑, 燕 邓 申请人:东南大学