专利名称：来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及苛求芽孢杆菌胞内和胞外两种可溶天然单纯蛋白质同四聚体尿酸酶， 及这两种天然尿酸酶的突变体和它们的聚乙二醇单甲醚修饰产物，这些尿酸酶和其聚乙二 醇单甲醚修饰产物在临床检验测定血清尿酸含量和降低哺乳动物体内的血浆尿酸水平中 的应用。发明的
背景技术：
尿酸酶可特异性氧化尿酸，并生成尿囊素和过氧化氢。人体缺乏尿酸酶，尿酸是体 内嘌呤碱代谢终产物，主要经肾脏排泄。血浆中尿酸浓度过高称为高尿酸血症。尿酸在血 浆中的溶解度低，浓度过高会在血管壁沉积，诱发组织器官损伤和引起痛风等疾病，严重时 造成肾衰，危及生命。故血清尿酸水平是诊断痛风和肾脏功能的常规指标，而尿酸酶是实验 诊断领域测定血清尿酸含量的关键工具酶。尿酸的前体黄嘌呤是尿酸酶的强效竞争性抑制 剂，而血浆高尿酸通常伴随血浆高黄嘌呤。因此，需要抗黄嘌呤且催化效率高的尿酸酶。在白血病、淋巴瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量死亡裂解，胞内核酸大量降 解造成血浆尿酸急剧升高，形成以高尿酸血症为代表的肿瘤溶解综合症(tumor lysis syndromeJLS)，容易造成患者肾衰而死亡。所以，在肿瘤化疗过程中，需快预防和速降低血 浆尿酸应对TLS。另外，降尿酸也是治疗痛风的关键策略；别嘌呤醇等药物都有明显肝肾毒 性易引起过敏反应，在初始尿酸浓度很高时无效且对某些难治性痛风无效。尿囊素的优良 水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄使尿酸酶成为治疗高尿酸血症相关疾病的候选药物。临 床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在应对肿瘤裂解综合 症时尿酸酶比别嘌呤醇更安全有效；尿酸酶可用于治疗痛风，给予一次尿酸酶后严重痛风 患者血浆尿酸水平可长时间维持正常。因此，抗黄嘌呤、催化效力高的尿酸酶也是治疗高尿 酸血症相关疾病的理想药物。已报道苛求芽孢杆菌可产生胞内和分泌到胞外的两种尿酸酶，但至今未明确此两 种尿酸酶的编码基因和对应的氨基酸序列。实验数据已证实苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶和胞 内尿酸的催化能力都很高，且抗黄嘌呤，在治疗高尿酸血症和血清尿酸测定两方面都可有 重要应用。苛求芽孢杆菌的天然胞内和胞外尿酸酶都可直接用于尿酸含量测定。外源尿酸 酶用于治疗高尿酸血症相关疾病时都需将其注射到血液中才能发挥作用。异源蛋白在人体 内半衰期短且易诱发机体免疫反应。用聚乙二醇单甲醚修饰蛋白是延长其体内半衰期、降 低其免疫原性的有效方法。常用的聚乙二醇单甲醚修饰试剂与蛋白质表面氨基或巯基反 应。对来自苛求芽孢杆菌的胞内和胞外尿酸酶及其突变体也可用活化聚乙二醇单甲醚修饰 其表面的氨基或巯基，从而延长其体内半衰期并降低此外源蛋白的免疫原性，保障用药的 安全性。所以，本发明涉及来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶及其对应突变体和聚乙二 醇单甲醚修饰产物，及它们在血清尿酸测定和应对哺乳动物高尿酸血症相关疾病等方面的 应用。
4
发明概述本发明提供来自苛求芽孢杆菌两种可溶性尿酸酶的氨基酸序列和编码它们的 cDNA序列及对两种酶蛋白和其突变体，及这些尿酸酶用聚乙二醇单甲醚进行修饰的方式和 这些对应尿酸酶的应用。同时，本发明还提供进行重组表达获得所需要尿酸酶和其突变体 的途径，及对此苛求芽孢杆菌尿酸酶表面的氨基用聚乙二醇单甲醚修饰或将特定位点的中 性氨基酸残基突变成半胱氨酸后对其巯基进行选择性修饰的方式。本发明所述来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶都可直接用于临床检验测定血 清尿酸含量；重组表达的此类尿酸酶和其突变体在其N端或C端带有连续的六个组氨酸残 基可作为标签用于亲和纯化；来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶和这些尿酸酶的突变体 重组表达产物都可用于动力学方法或者终点平衡法测定血清尿酸。用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的分子量在2000DaltOn及以上的聚乙二醇单甲醚可在碱性条件下修饰本发明所述的天然尿酸酶或重组表达突变体酶蛋白表面的氨基；如是带 有特定位置发生定点突变所生成的半胱氨酸残基的重组表达突变体尿酸酶，就可用聚乙二 醇单甲醚的碘乙酸酯或溴乙酸酯修饰这些巯基从而实现位点特异性修饰。用上述聚乙二醇 单甲醚修饰后的这些尿酸酶及其突变体都可用于治疗和预防哺乳动物，尤其是灵长类动物 高尿酸血症相关的疾病，包括肿瘤溶解综合症和痛风等；在应用中单次给药后体内尿酸在 较长时间内可维持在正常水平，从而有效缓解和预防高尿酸血症相关的疾病。应用实施例实施例1 血清尿酸测定本实施例说明此尿酸酶在直接动力学方法测定血清尿酸中的应用。尿酸酶活性用 75μΜ尿酸在25°C的硼酸钠缓冲液(pH 9. 2)中测定，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶量为一 个单位。(1).反应体系含15μ 1血清，5μ 1重组表达的胞内尿酸酶(>6U/mg，如未声明则 其浓度大于6. OU/ml，在反应体系的终浓度大于0. 0025U/ml)和pH9. 2的硼酸钠缓冲液共 1. 20ml ο(2).测定加入尿酸酶启动反应前体系在293nm的吸收，校正加入酶液的体积效应 (0.3% )和酶制剂吸收(低于0. 004)得酶作用前吸收(AO)。(3).将加入酶后的混合物在石英比色杯内混勻，在加酶30秒后以10到30秒间隔 监测293nm吸收在5min内的变化(最大吸收低于1. 270)，代表性反应曲线如附图1。(4).尿酸消光系数固定为11. 5(mmol -Γ1 κπιΓ1，米氏常数(Km)固定为0. 22mmol/ L (如用来自苛求芽孢杆菌尿酸酶的突变体则需要实验测定其米氏常数)，用以反应时间为 自变量的积分速度方程拟合反应曲线(见附图1)预测本底(Ab)。Atl和Ab之差，S卩ΔΑ，代 表反应体系中尿酸的吸收(详细数据处理方法见中国发明专利专利ZL03135649. 4)。实施例2 重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的聚乙二醇单甲醚5000修饰用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚修饰苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达产物 是其用于哺乳动物体内降低血浆尿酸水平的前提，修饰其氨基的代表性操作过程如下(1).在25°C的0. IM硼酸钠缓冲液中(pH 9. 2)用75. 0 μ M尿酸测定尿酸酶活性。(2).将序列5对应苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达，Ni-NTA柱亲和层析纯化到 10. OU/mg以上，冻干浓缩到6. Omg/ml后对含有0. IM硼酸钠的缓冲液透析12小时，每4小时更换一次透析外液，直到用2，4，6_三硝基苯磺酸或荧光胺测定无明显的小分子氨基化 合物为止。(2).用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐生成其羧基衍生物，纯化后 与N-羟基琥珀酰亚胺用二环己基碳二亚胺脱水生成对应的N-羟基琥珀酰亚胺酯，纯化产 物。(3).测定透析后无氨基化合物的重组胞内尿酸酶的蛋白浓度，按编码序列对应分 子量计算其所含氨基数量，按照摩尔当量比值递增方式逐步增加N-羟基琥珀酰亚胺酯活 化的聚乙二醇单甲醚5000量，然后在pH9. 0的硼酸钠缓冲液中混勻，室温反应3小时后取 样测定剩余的尿酸酶活性；反应体系活化聚乙二醇单甲醚5000量对修饰后剩余酶活性的 影响如附图2。(4).将聚乙二醇单甲醚修饰的此重组表达胞内尿酸酶对生理盐水多次换液透析 后备用。实施例3 离体人血浆中聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的降 尿酸作用用离体血浆中的降尿酸活性表征聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内 尿酸酶的降尿酸活性比用氧嗪酸抑制内源性尿酸酶的动物灌胃给尿酸后测定的降尿酸活 性更可靠，因为消除了所用氧嗪酸对药用聚乙二醇单甲醚修饰尿酸酶抑制作用的干扰。(1).通过跟踪293nm吸收变化检测反应进程，在25°C硼酸钠缓冲液(pH 9. 2)测 定其氧化75 y M尿酸的初速度表示活性，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶活性为一个单位。(2).将聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶对生理盐水换液透析， 用0. 22 y m的微孔滤膜除菌后备用。(3).来自血液中心的健康个体血浆，加入固体尿酸粉末到终浓度高于0. 40mM以 上，加入体积比例小于2%而终浓度为16U/L的聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞 内尿酸酶，在指定时间取样0. 20ml，迅速加入20iU浓度为55%的高氯酸混勻终止尿酸酶作用。(4).在上述终止反应的样品中加入在25 °C饱和的碳酸钾溶液20 u 1使得体系的 PH高于7. 0，剧烈震荡混勻后2000g离心10分钟后取上清液为待测样品，按照应用实施例 1中所述测定残余尿酸的含量；所得血浆尿酸水平随着时间变化的代表性结果如附图3。(5).在血浆中加入0. 30mM黄嘌呤考察其对降尿酸效力表明此尿酸酶明确抗黄嘌 呤。实施例4 聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在大鼠体内的变 化。未经过聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在哺乳动物体内2 小时内活性降低到10%以下；而经过聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸 酶在哺乳动物体内血浆中活性衰减速度明显减慢。(1).在25°C硼酸钠缓冲液(pH 9. 2)测定其氧化75 y M尿酸的初速度表示活性， 每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶活性为一个单位。(2).将聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶对生理盐水换液透析， 用0. 22 y m的微孔滤膜除菌后备用。
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(3).将成年的健康大鼠乙醚麻醉，尾静脉注射灭菌的聚乙二醇单甲醚修饰重组苛 求芽孢杆菌胞内尿酸酶0. 60U总量(0. 25ml)。(4).在注射尿酸酶之前、之后指定时间眼球取血，肝素钠抗凝制备血浆，测定血浆 中的尿酸酶活性变化，代表性的结果如附图4。
图1.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶测定血清尿酸含量的反应进程。图2.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化聚乙二醇单甲醚 5000修饰后的剩余活性随所用活化聚乙二醇单甲醚对氨基当量比值的变化。图3.离体人血浆中尿酸在聚乙二醇单甲醚5000修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸 酶作用下的衰减曲线。图4.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶经聚乙二醇单甲醚5000修饰后在大鼠体内活 性衰减过程。氨基酸和编码区DNA序列表
<110> 重庆医科大学
<120>来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用
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1权利要求
两种尿酸酶蛋白，所述这两种尿酸酶蛋白中天然酶蛋白都是来自苛求芽孢杆菌的同四聚体单纯蛋白质，都可用分子氧催化尿酸氧化并生成过氧化氢。
2.按照权利要求1所述的两种尿酸酶，其包括从苛求芽孢杆菌胞内和胞外蛋白中纯化 的且具有序列1和序列3的氨基酸序列的可溶天然尿酸酶，及这两种天然尿酸酶蛋白N端 前七个氨基酸残基中有部分残基被替换或缺失的突变体、或前述两种天然尿酸酶蛋白C端 缺失不多余14个残基的突变体、或前述两种天然尿酸酶蛋白中N端前七个氨基酸残基被替 换或缺失且同时C端缺失不多于14个氨基酸残基的突变体、或在两种天然尿酸酶的N端前 七个氨基酸残基中存在替换且N端朝前延伸了不多于十个中性侧链氨基酸残基的突变体、 或在两种天然尿酸酶的N端前七个氨基酸残基中存在替换且N端朝前延伸了不多于十个中 性侧链氨基酸残基同时C端缺失不多于十四个氨基酸残基的突变体，及这些尿酸酶和其突 变体的聚乙二醇单甲醚修饰产物。
3.按照权利要求2所述的两种尿酸酶，可从苛求芽孢杆菌胞内或分泌到胞外的可溶蛋 白中纯化，对应天然尿酸酶蛋白同四聚体每个亚基含有332个氨基酸，其氨基酸序列分别 为序列表中的序列1和序列3 ；对应的尿酸酶蛋白突变体可通过基因重组后原核表达获得， 在重组表达时可在C端或N端再添加五个到七个连续组氨酸残基作为亲和层析纯化的标 签，对应尿酸酶蛋白同四聚体的每个亚基含305到360个氨基酸残基；这两种尿酸酶及其突 变体的等电点都在4. 0到6. 5之间。
4.按照权利要求2和权利要求3所述的两种尿酸酶，可通过基因重组表达获得对应 尿酸酶蛋白突变体，且这些尿酸酶蛋白突变体中部分位置的中性侧链氨基酸残基可突变成 半胱氨酸残基以便用溴乙酰或碘乙酰活化的聚乙二醇单甲醚进行修饰，这些可突变成半胱 氨酸残基的中性氨基酸残基包括序列1中16、52、55、81、101、131、156、163、174、187、233、 237、254、263所对应丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等残基中的任一个或任意多个的 组合，及序列3中对应位置的残基。
5.按照权利要求2和权利要求3和权利要求4所述两种尿酸酶蛋白具有以下特征A、来自苛求芽孢杆菌胞内可溶蛋白的天然尿酸酶氨基酸排序如序列1；其N端前七个 氨基酸残基可被替换或截短仍保留尿酸酶活性，但N端的前七个氨基酸残基被截短后突变 体尿酸酶的活性会下降；N端可朝前延伸不多于十个中性侧链氨基酸残基并可再包含用于 亲和纯化的连续组氨酸残基标签序列；序列1中的第144位氨基酸残基可以是丙氨酸且仍 保留活性。B、来自苛求芽孢杆菌分泌到胞外的可溶尿酸酶氨基酸排序如序列3，其N端对应的前 七个氨基酸残基与序列1的N端残基不同而其余氨基酸序列全部相同，可突变成半胱氨酸 的中性侧链氨基酸残基位置和组合方式也与胞内尿酸酶相同；序列3中的第144位氨基酸 残基可以是丙氨酸且仍保留活性。C、来自苛求芽孢杆菌胞内和分泌到胞外的两种天然尿酸酶催化能力相当；两种天然尿 酸酶对黄嘌呤的敏感性相当且都比常见真核尿酸酶敏感性低得多；两种天然尿酸酶突变体 对底物尿酸的亲和力较低，对尿酸的米氏常数在0. 10mmol/L以上；两种天然尿酸酶对水透 析都会解聚成二聚体而失活，但用高离子强度的缓冲液处理时对水透析失活的这两种天然 尿酸酶的大部分活性都可恢复。D、这两种天然尿酸酶和其突变体都可在大肠杆菌中重组表达，并可用N-羟基琥珀酰亚胺活化的平均分子量不低于2000DaltOn的聚乙二醇单甲醚在碱性条件下修饰其氨基， 修饰后可保留45%以上的催化活性；也可用碘乙酰或溴乙酰活化的聚乙二醇单甲醚修饰 突变所得半胱氨酸残基，并保留更高的比活性。E、这两种天然尿酸酶及其突变体经平均分子量不低于2000DaltOn的聚乙二醇单甲醚 修饰后，在哺乳动物血浆中可有效降低血浆尿酸，且在动物体内10小时内活性可保留30% 以上；但未经聚乙二醇单甲醚的两种天然尿酸酶或它们的突变体在大鼠体内2小时内活性 就降到10%以下。
6.这两种天然尿酸酶及其各种突变体可直接用于终点平衡法测定反应前和反应完成 后293nm紫外吸收之差确定反应体系的底物尿酸含量，或与过氧化物酶联合用于间接终点 平衡法测定对应于过氧化氢的有色产物量间接确定反应体系的尿酸含量；也可用于动力学 方法预测尿酸酶反应体系本底快速测定反应体系的底物尿酸含量，这种方法的数据处理可 采用中国发明专利ZL03135649. 4所要求的专属方法。
7.这两种天然尿酸酶及其突变体经聚乙二醇单甲醚修饰后都可用于预防和治疗人体 的高尿酸血症相关疾病，包括痛风及淋巴瘤、白血病等化疗时导致的肿瘤溶解综合症；这两 种天然尿酸酶及其突变体用于降低人体血浆尿酸的应用方式包括静脉注射到血液和在血 液体外透析时使用；经静脉注射到血浆中发挥作用时这些天然尿酸酶及其突变体经聚乙二 醇单甲醚修饰封闭抗原决定簇和延长其体内半衰期；这两种尿酸酶及其突变体也可在血 液透析治疗时在体外使用降低血浆尿酸水平，对应这种应用方式所用这两种天然尿酸酶及 其突变体可不经过聚乙二醇单甲醚修饰，且这种使用方式也不限于本发明所述的各种尿酸 酶。
全文摘要
来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用；具体涉及来自苛求芽孢杆菌胞内和胞外的两种天然尿酸酶的同四聚体及它们各自的氨基酸序列，及这两种尿酸酶的N端前七个氨基酸缺失或被替换的突变体、C端缺失不多于十四个氨基酸残基的突变体和同时出现上述两类变化的突变体；这两种天然尿酸酶都抗黄嘌呤且对尿酸亲和力较低，在离子强度低时会解聚而失去活性；这些天然尿酸酶和其突变体都可在N端或C端带组氨酸纯化标签后用大肠杆菌进行重组表达，都可用于测定血清尿酸含量，都可用平均分子量不低于2000的聚乙二醇单甲醚修饰后保留大部分比活性，从而可用于哺乳动物体内降低血浆尿酸水平治疗高尿酸血症相关疾病。
文档编号G01N21/33GK101875922SQ20091010374
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者冯娟, 卜友泉, 廖飞, 张纯, 李想, 杨晓兰, 谢燕玲, 赵运胜 申请人:重庆医科大学