离子通道药物筛选装置及方法

专利名称：离子通道药物筛选装置及方法
离子通道药物筛选装置及方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选技术，尤其是涉及一种离子通道药物筛选装置及方法。背景技术：
离子通道蛋白是通过调节细胞内外离子水平而发挥作用的大分子膜蛋白， 其结构和功能的异常可能会导致各类疾病的发生。把离子通道作为药物作用的 靶点，可以治疗高血压、心率失常、癫痫、老年性痴呆、神经痛、糖尿病和高
血钾性周期性麻痹等疾病。但目前离子通道药物在市场上仅占全部药物的7%, 这类药物的开发有待于新的高通量药物筛选技术的问世。
传统的离子通道药物筛选采用膜片钳技术。膜片钳是离子通道药物筛选和 离子通道研究的最好方法，但由于其只适用于单一细胞，；险测样品通量低，限 制了其在药物筛选中的应用。
针对其低通量的缺点，发展出了膜片钳阵列技术和基于荧光的检测技术。
膜片钳阵列技术简化了膜片钳操作，增加了膜片钳筛选通量。例如，QPatch 系统，它是一套基于平面芯片技术的高通量全自动膜片钳系统，抛弃了传统的 玻璃电极，采用QPlateSealChip平面电极芯片， 一定密度的细胞悬液灌注在芯片 上面，随机下降到芯片上约1 -2 ji m的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接， 打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。该系统可以同时记录48个细胞，与 单一细胞记录的传统膜片钳技术相比，它每天可记录250-1200个数据，筛选数 以千计的化合物，适用于离子通道的基础研究以及药物筛选的任何阶段，包括 针对化合物文库的初期药筛。目前该系统被广泛应用于HERG通道、KCNQ4、 Navl.2、 Navl.4、 Navl.5等电压门控性离子通道以及ASIC、 nAChR、 GABAa 配体门控性通道等的研究。
基于荧光的检测技术(CellLux)也被广泛用于离子通道药物的筛选，这类 技术需要对靶标或者与细胞功能变化密切相关的一些信号分子进行荧光标记， 当被筛选药物与靶标相互作用时，引起相应荧光强度改变，就可以得到药物与靶标的作用信息。尤其是应用荧光共振能量转移(FRET)技术，根据细胞去极 化前后的荧光比率间接反映细胞膜电压的变化，适用于离子通道模型上的高通 量药物筛选。CellLux细胞荧光工作站就是这类可进行荧光^r测的多功能细胞成 像平台，用于药物研究中的检测平台开发、第一轮和第二轮的药物筛选。它可 以进行钓流检测、膜电位检测、同步FRET检测，实现数据同步读取，并集成 了液体处理功能，以及光纤成像功能，完全实现"无需人工干预式"的自动化。 这种荧光标记的检测最大的优点是高通量，使用384孔板每天可以检测10， 000 个数据。
基于荧光的检测技术由于假阳性率高、缺少跨膜电压对照以及时间分辨率 低等，只在药物初级筛查中占优势地位。另外，对于复合检验来说，任何单一 的检验都不可取，主要应用的仍是自动化膜片钳技术。而自动化膜片钳技术仍 然不能被看作高通量技术，还需要做大量改进，而且其成功率较低， 一般为 60-70%，精确测量一些快速反应事件的能力也较差。

发明内容
有鉴于此，有必要针对传统的离子通道药物筛选方法成功率较低的问题， 提供一种离子通道药物筛选方法。
一种离子通道药物筛选方法，包括如下步骤将带光^1感离子通道蛋白的 细胞灌注到芯片；对灌注到芯片中的带光敏感离子通道蛋白的细胞进行光照处 理；记录参照跨膜电信号；给药；记录给药后跨膜电信号；分析给药前的参照 跨膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号，判断药物对离子通道影响。
在优选的实施方式中，还包括制备带光敏感离子通道蛋白的细胞的步骤。
在优选的实施方式中，所述制备带光敏感离子通道蛋白的细胞的步骤包括 如下步骤将光敏感离子通道蛋白的基因整合到病毒核酸上；用病毒感染细胞， 将光敏感离子通道蛋白的基因带到细胞中形成所述带光敏感离子通道蛋白的细 胞。
在优选的实施方式中，所述光敏感离子通道蛋白为ChR2蛋白或NphR蛋白。
5在优选的实施方式中，所述光照4吏用的光波的波长为472nrn或593nm。 此外，还提供了一种离子通道药物筛选装置。
一种离子通道药物筛选装置，包括芯片、光源、给药系统及记录分析系统， 所述芯片用于放置带光敏感离子通道蛋白的细胞及接收待筛选的药物；所述光 源用于产生使光敏感离子通道蛋白敏感的光；所述给药系统与所述芯片相连将 药物传送到芯片放置所述细胞的位置；所述记录分析系统与芯片相连分别获取 给药前在光照情况下的参照跨膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号，通过比 较给药前后电信号的变化从而筛选出有效的药物。
在优选的实施方式中，所述芯片上设有放置所述带光敏感离子通道蛋白的 细胞的收容槽，所述收容槽的直径为l-2mm。
在优选的实施方式中，所述芯片集成膜片钳阵列，在所述芯片的底层上对 应每一个收容槽设有一个l-2pm的小孔。
在优选的实施方式中，所述芯片上包含有供液体流动的通道、泵、阀、混 合器、过滤器和分离器，并且被给药系统所控制，所述给药系统通过控制所述 芯片的通道、泵、阀、混合器、过滤器和分离器，实现药物的樣i流体控制。
在优选的实施方式中，所述记录分析系统还与所述光源相连，控制所述光 源发光。
在优选的实施方式中，所述光源发出的光波的波长为472nm或593nm。 上述离子通道药物筛选装置及方法利用光控制离子通道，可以统一控制细
胞的离子通道的开关，便于准确获知药物对离子通道的影响，从而提高离子通
道药物筛选的成功率。


图1为光^:感离子通道蛋白受蓝光调控的示意图2为光壽丈感离子通道蛋白受黄光调控的示意图3为细胞的离子通道受光调控的示意图4为光刺激产生的动作电位示意图5为制备带光敏感离子通道蛋白的细胞的流程图；图6为制备带光敏感离子通道蛋白的细胞的示意图;
图7为离子通道药物筛选方法流程图8为离子通道药物筛选装置的模块图9为芯片的结构示意图IO为芯片的工作原理示意图11为芯片输出的信号示意图。
具体实施方式
在以下离子通道药物筛选装置及方法中，将光敏感离子通道蛋白导入细胞 中，这样利用光就可以控制离子通道的开关。先施以一定波长的光调控，打开 或关闭离子通道，通过膜片钳记录到细胞的跨膜电信号；再通过给药系统给予 芯片不同孔内的细胞以不同的待筛选药物，记录相应跨膜电信号的改变；根据 电信号的变化进行分析，从而筛选出能发挥效用的药物。
不同的光敏感离子通道蛋白对不同波长的光敏感，从而可以相应控制不同 的离子ii7v细胞。如图l所示，ChR2(Channelrhodopsin-2)蛋白对蓝光(472nm 波长)敏感，蓝光可使Na+、 Ca^等阳离子进入细胞，使细胞膜发生去极化而兴 奋。如图2所示，NphR (Helorhodopsin)蛋白对黄光(593nm波长)敏感，可使
cr进入细胞膜复极化而抑制细胞活性，这样利用交替的蓝光或黄光就可以在特
定的细胞水平控制离子通道的开关。图3所示为细胞受光调控引起跨膜电信号 的变化。将ChR2或NphR导入细胞中后，离子通道蛋白ChR2或NphR在细胞 膜上表达，外部光源(例如472nm和593nm波长)可以控制通道蛋白的开关， 膜片钳可以记录到的3争膜电信号变化(如图4所示)。
传统的离子通道药物筛选方法中，由于在加入药物前无法准确获知离子通 道的开启关闭情况，也就无法准确获知药物对离子通道的影响。利用光控制离 子通道，可以统一控制细胞的离子通道的开关，便于准确获知药物对离子通道 的影响，从而提高离子通道药物筛选的成功率。
以下根据光敏感离子通道蛋白对光敏感的原理，结合具体的附图进行详细 说明。如图5所示，为制备带光敏感离子通道蛋白的细胞的流程图，其是利用基 因的方法，用病毒载体将光敏感通道蛋白的基因ChR2或NphR导入特定的细胞 中表达而实现的
首先，步骤S502，将光敏感离子通道蛋白的基因整合到病毒核酸上。光敏 感离子通道蛋白的基因存在于细菌IO(结合参阅图6)的质粒中，与病毒20(如 慢病毒、腺病毒)作用后，整合到病毒20的核酸上，形成带光敏感离子通道蛋 白的病毒22。携带光敏感离子通道蛋白的细菌IO的质粒可以应用分子克隆技术 设计并制备。
然后，步骤S504,用病毒感染细胞，将光敏感离子通道蛋白的基因带到细 胞中。带光敏感离子通道蛋白的病毒22与细胞30作用，将光敏感离子通道蛋 白的基因带到细胞30中，形成带光敏感离子通道蛋白的细胞32。从而在带光敏 感离子通道蛋白的细胞32的细胞膜上表达光敏感通道蛋白，例如ChR2或NphR等。
在获得带光敏感离子通道蛋白的细胞32后，即可利用带光敏感离子通道蛋 白的细胞32进行药物筛选。如图7所示，为离子通道药物筛选方法的流程图。
首先，步骤S702，将带光敏感离子通道蛋白的细胞32灌注到芯片。带光敏 感离子通道蛋白的细胞32经培养增殖后灌注到芯片的小槽中，用于药物筛选。
步骤S704,光照。对灌注到芯片中的带光^t感离子通道蛋白的细胞32进行 光照处理。例如以472nm或593nm波长的外部光源控制离子通道的开关。
步骤S706,记录参照跨膜电信号。记录给药前在光照情况下的跨膜电信号， 作为参照跨膜电信号。电信号可以是电流信号或者电压信号。
步骤S708，给药。在带光敏感离子通道蛋白的细胞32的培养环境中加入需 要筛选的药物。
步骤S710，记录给药后跨膜电信号。记录给药后在光照情况下的跨膜电信 号，作为给药后跨膜电信号。
步骤S712，分析给药前的参照跨膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号， 判断药物对离子通道影响。如果给药前后跨膜电信号的变化满足预定的要求， 通常表明药物对离子通道产生了预期的影响。图8为离子通道药物筛选装置的模块图，离子通道药物筛选装置包括芯片 810、光源820、给药系统830及记录分析系统840。
芯片810用于放置带光敏感离子通道蛋白的细胞32及接收待筛选的药物。 图9所示是芯片810的结构示意图。芯片810设有药物输入端811与给药系统 830相连。药物从芯片一端的上层的药物输入端811输入，细胞从另一端的细胞 输入端813输入。细胞内液从药物输入一端的下层的细胞内液输入端815输入， 记录电极817和参考电极819分别位于芯片两端。如图IO所示，芯片810上设 有收容槽812,收容槽812的直径为l-2mm，收容槽812内放置带光敏感离子通 道蛋白的细胞32。芯片810上还集成了膜片钳阵列，在芯片810的底层814上 对应每一个收容槽812设有一个l-2pm的小孔816，相当于微管电极，通过调节 压力，使收容槽812内的细胞32定位在小孔816上，破膜后与细胞内液50接 通，而收容槽812内的液体为细胞外液40，记录电信号完成膜片钳操作。
光源820用于产生使光敏感离子通道蛋白敏感的光，例如472nm或593nm 波长的光，并将产生的光照射到芯片810的收容槽812内，以开关细胞32的离 子通道。
给药系统830与芯片810相连将药物传送到芯片810放置细胞32的位置。 给药系统830将药物通过微流体技术传送到芯片810的收容槽812内，例如导 入到收容槽812中的细胞外液40中。芯片810上包含有一组供液体流动的通道、 泵、阀、混合器、过滤器和分离器等元件，并且能够被给药系统830所控制。 给药系统830可以为计算机，通过控制芯片810的通道、泵、阀、混合器、过 滤器和分离器等元件，实现药物的微流体控制。
记录分析系统840与芯片810相连分别获取给药前在光照情况下的参照跨 膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号，通过比较给药前后电信号的变化从而 篩选出有效的药物。记录分析系统840还与光源820相连，控制光源820自动 发光。
实施时，先输入细胞，芯片的每个小槽内输入一个细胞，用光控制细胞膜 上离子通道的开关，再从芯片另一端输入药物，每个槽内可以输入不同浓度的 同一种药物或同一浓度的不同药物。同时用记录电极817和参考电极819记录给药前后细胞膜膜电位的变化。图11所示是记录到的每个槽内细胞的膜电位， 通过与给药前的膜电位对比，就可以筛选出有效的药物。
通过光控制离子通道的开关具有空间上的细胞特异性(带有某一启动子的 病毒载体将光敏感通道或泵蛋白基因导入其相应的细胞中表达)和时间上毫秒 水平上的精确性。由于采用光控制技术，所以可以实现快速反应的要求，又因 为其具有时间上的精确性，所以可以取代自动化膜片钳技术进行药物筛选，具
有高通量、可控制性强、速度快、实时性高、准确度好等特点。
上述离子通道药物筛选装置及方法可应用于筛选可诱导肿瘤干细胞凋亡的 药物。肿瘤是一种干细胞疾病。大量的研究提出了这样一个假设，即肿瘤之所 以能具有无限增殖能力，其罪魁祸首在于肿瘤细胞中存在只占极少数量的肿瘤 干细胞，正是这类细胞在人体中以极快的速度不断复制出有基因突变的细胞， 导致了器官正常功能的紊乱，并最终导致机体死亡。传统的肿瘤治疗都是针对 于所有的肿瘤细胞，但如果肿瘤的发病源于干细胞，则可认为肿瘤是一种干细 胞疾病，那么先前关于胂瘤的发生发展机制、细胞信号转导途径等研究成果需 要重新进行评价。目前对于干细胞上存在离子通道的假说已经得到证实，那么 将该光敏感通道蛋白特异性地诱导入各类肿瘤干细胞，用这些细胞进行药物筛 选，可以快速而有效地筛选出引起这类肿瘤干细胞凋亡的药物。
以上所述实施例^f又表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
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权利要求
1、一种离子通道药物筛选方法，其特征在于，包括如下步骤将带光敏感离子通道蛋白的细胞灌注到芯片；对灌注到芯片中的带光敏感离子通道蛋白的细胞进行光照处理；记录参照跨膜电信号；给药；记录给药后跨膜电信号；分析给药前的参照跨膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号，判断药物对离子通道影响。
2、 根据权利要求1所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，还包括制 备带光^:感离子通道蛋白的细胞的步骤。
3、 根据权利要求2所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述制备 带光敏感离子通道蛋白的细胞的步骤包括如下步骤将光敏感离子通道蛋白的 基因整合到病毒核酸上；用病毒感染细胞，将光敏感离子通道蛋白的基因带到 细胞中形成所述带光壽丈感离子通道蛋白的细胞。
4、 根据权利要求1所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述光敏 感离子通道蛋白为ChR2蛋白或NphR蛋白。
5、 根据权利要求4所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述光照 4吏用的光波的波长为472nm或593nm。
6、 一种离子通道药物筛选装置，其特征在于，包括芯片、光源、给药系统 及记录分析系统，所述芯片用于放置带光敏感离子通道蛋白的细胞及接收待筛 选的药物；所述光源用于产生使光敏感离子通道蛋白敏感的光；所述给药系统 与所述芯片相连将药物传送到芯片放置所述细胞的位置；所述记录分析系统与 芯片相连分别获取给药前在光照情况下的参照跨膜电信号和给药后的给药后跨 膜电信号，通过比较给药前后电信号的变化从而筛选出有效的药物。
7、 根据权利要求6所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述芯片 上设有;^文置所述带光^:感离子通道蛋白的细胞的收容槽，所述收容槽的直径为 l-2mm。
8、 根据权利要求7所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述芯片集成膜片钳阵列，在所述芯片的底层上对应每一个收容槽设有一个l-2pm的小 孔。
9、 根据权利要求6所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述芯片 上包含有供液体流动的通道、泵、岡、混合器、过滤器和分离器，并且被给药 系统所控制，所述给药系统通过控制所述芯片的通道、泵、阀、混合器、过滤 器和分离器，实现药物的微流体控制。
10、 根据权利要求6所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所述记 录分析系统还与所述光源相连，控制所述光源发光。
11、 根据权利要求6或IO所述的离子通道药物筛选方法，其特征在于，所 述光源发出的光波的波长为472nm或593nm。
全文摘要
一种离子通道药物筛选方法，包括如下步骤将带光敏感离子通道蛋白的细胞灌注到芯片；对灌注到芯片中的带光敏感离子通道蛋白的细胞进行光照处理；记录参照跨膜电信号；给药；记录给药后跨膜电信号；分析给药前的参照跨膜电信号和给药后的给药后跨膜电信号，判断药物对离子通道影响。上述离子通道药物筛选方法利用光控制离子通道，可以统一控制细胞的离子通道的开关，便于准确获知药物对离子通道的影响，从而提高离子通道药物筛选的成功率。此外，还提供了一种离子通道药物筛选装置。
文档编号G01N33/566GK101498723SQ20091010566
公开日2009年8月5日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者楠 刘, 洁 屠, 王立平, 晖 祁 申请人:深圳先进技术研究院