专利名称：：β-类兴奋剂的液质联用测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种e-类兴奋剂的液质联用测定方法，特别是检测饲料中P-类兴奋剂的方法。
背景技术：
：盐酸克伦特罗和莱克多巴胺都属于P-类兴奋剂，类兴奋剂是一类人工合成药物，主要用于防治人、兽支气管哮喘和支气管痉挛。e-类兴奋剂能促进动物体内蛋白质沉积，抑制脂肪沉积，具有营养"再分配效应"。因此，有人用来作为饲料添加剂，提高猪酮体的瘦肉率。但是，它容易在动物脏器中积聚残留，并可通过食物链进入人体，导致一系列的药物残留问题，如急性中毒有心悸，面、颈、四肢肌肉颤抖，手抖甚至不能站立，头晕、全身无力、心动过速、室性早搏、心电图示S-T段压低与T波倒置；原有交感神经功能亢进的患者，如有高血压、冠心病者上述症状更易发生；糖尿病人可引起酮中毒，与糖皮质激素合用可引起低血钾，从而导致心律失常，严重的可能危及生命。P-类兴奋剂主要有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。其中我国最早使用的是盐酸克伦特罗，俗称"瘦肉精"，但是在发生了一系列的"瘦肉精"中毒事件以后，为了保障人民的身体健康和生命安全，我国将盐酸克伦特罗列入了禁用药品目录。然而人们为了追求畜牧业更快的发展和最佳的经济效益，就使用盐酸克伦特罗的替代品莱克多巴胺，动物在食用含莱克多巴胺的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，导致消费者出现不同程度的中毒现象。目前，分别检测盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等。但是，高效液相色谱法检测灵敏度低，难以达到规定的最低检测限；气相色谱-质谱联用法需要对样品进行衍生化，实验过程复杂；酶联免疫法仅针对尿样中的e-类兴奋剂进行检测，应用具有一定的局限性
发明内容本发明的目的是提供一种快速、准确的P-类兴奋剂的液质联用测定方法。本发明包括下列步骤A、样品提取在样品中加入2045ml提取溶剂，采用微波萃取法提取样品中的目标物，微波萃取温度在8010(TC，压力为4.06.0atm，时间为812min，然后以转速5000r/min离心25min，用2mol/LNaOH调pH至1112，得一次上清液；再用37ml乙酸乙酯萃取，重复萃取条件一次，得二次上清液，合并两次上清液；提取溶剂为水和乙腈，水和乙腈的体积比为70:30;B、样品净化将A步骤合并后的上清液于6(TC旋转蒸干，用2ml浓度2%甲酸溶解，过OasisMCX小柱，先用2ml浓度100%的甲醇洗脱，弃去；再用2ml浓度8X的氨水溶液洗脱，弃去，氨水溶液中的甲醇与水的比例为30:70;最后用2ml体积百分含量为8%的氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮气吹干，用流动相定容至lml，过0.22to微孔滤膜，上机；C、液相色谱检测条件是色谱柱为ACQUITYUPLCTMC18柱，规格为2.lramX50ramX1.7陶，流动相为4mmol/L乙酸胺-乙腈，乙酸胺与乙腈的体积比为80:20，流速为3ml/min，进样量为51^1，柱温为室温；D、质谱检测条件是采用电喷雾离子源，负离子多反应检测扫描；雾化器压力为30psi;干燥气流速为7.5L/min;扫描范围为190300m/z，加热温度35°C。本发明用微波萃取进行样品前处理，具有理想的回收率和准确度，在超高压液相色谱测定方法中所用流动相具有一定的ra缓冲能力，因此PH不易变化，从而保证了分析结果的重复性和重现性，同时由于超高压液相色谱的柱效高，因而灵敏度高，检测速度快，节省检测时间。本发明能够快速、准确地对饲料中3-类兴奋剂进行定量测定，具有通用性，可较好地满足实际工作的需要。本发明液质联用方法是在现有高效液相色谱技术基础上发展起来的，是以高效液相色谱为分离手段、质谱为检测器的一门综合性分析技术，具有液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度、极强的定性专属特异性的特点。但是由于液质联用技术起步比较晚，之前进行的兽药残留检测工作一般都用高效液相色谱进行分析，本发明第一次用液质联用技术对e-类兴奋剂的残留进行了定性定量分析，通过反复试验，得到了最优的液相色谱测定条件和质谱条件。本发明采用的微波萃取法与超声法、震荡法、涡旋法相比具有提取效率高、速度快等优点，结果见表l;所用的提取溶剂与其他提取溶剂相比有较好的回收率，结果见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>津腾针筒式微孔滤膜0.22um有机系滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)2)实验试剂莱克多巴胺(Sigma公司)盐酸克伦特罗(Sigma公司)乙酸乙酯(天津市科盟化工工贸有限公司)甲醇(色谱纯)(德国Merck公司)乙腈(色谱纯)(德国Merck公司)超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)甲酸(莱阳化工实验厂)2.实验设计如下1)在本实施例中，用盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的混合标准品摸索并确定最佳的色谱条件和质谱条件。2)用已确定的方法测定待测饲料，确定其是否含有盐酸克伦特罗和莱克多巴胺。3)在待测饲料样品中添加盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限。3.实验方法如下1)加标样品制备-准确称取5.Og粉碎好的饲料于聚四氟乙烯微波萃取罐中，分别加入浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺混合标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化。2)样品提取在制备好的样品中，加入30ml提取溶剂(21ml乙腈+9ml水)，进行微波萃取，将上清液移至鸡心瓶中，转速5000r/min离心3min，然后用2mol/LNaOH调pH至11-12，再用5ral乙酸乙酯萃取，上清液移至另一鸡心瓶中，重复一次，合并上清液。微波萃取条件温度90°C;压力5.Oatin;时间lOmin。3)样品净化将上清液于6(TC旋转蒸干，用2ml浓度2%甲酸溶解，过OasisMCX小柱后(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脱，弃去；再用2ml浓度8%的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇与水的比例为30:70)洗脱，弃去；最后用2ml体积百分含量为8%氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮气吹干，用流动相定容至lml，过0.22Mm微孔滤膜，上机。4)液相色谱条件a)色谱柱ACQUITYUPLCC18(2.1mmX50画X1.7Wn)柱；b)流动相4,1/1乙酸胺:乙腈二80:20;c)流速3ml/min;d)进样量5W;e)柱温室温。5)质谱条件a)离子源电喷雾离子源；b)扫描方式负离子扫描；C)雾化气压力30psi;d)干燥器流速7.5L/min;e)扫描范围为190300m/z;f)加热温度35°C。4.实验结果1)标准溶液的配制分别精密称取50mg的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺标准品，用甲醇溶解并定容至100mL,配成2种浓度为500ug/ml的标准储备溶液，再稀释50倍即为10ug/ml的标准工作液，分别在4'C下保存。2)方法的标准曲线方程和相关系数将2种3-类兴奋剂的标准工作液混合，取五个浓度分别为0.25ug/ml、0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.Oug/ml的混合液注入超高压液相色谱-质谱/质谱联用仪，2种0-类兴奋剂的线性方程及相关系数见表4。表4两种药物的标准曲线方程和相关系数药物名称线性方程相关系数盐酸克伦特罗Y=0.5386x+0.04370.9998莱克多巴胺Y二O.1252x+0.04500.9996Y-色谱峰面积；X-浓度3)方法的回收率和精密度对添加了1.0呢/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺混合标准溶液的饲料进行重复性试验。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表5。表5两种药物的回收率和精密度(n=6)组分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4)方法的检出限根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检出限分别为8Pg/kg和5Pg/kg。<实施例2〉1.实验仪器与试剂如下1)实验仪器同实施例1;2)实验试剂同实施例1;2.实验方法如下1)加标样品制备准确称取5.Og粉碎好的饲料于聚四氟乙烯微波萃取罐中，分别加入浓度为LOmg/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺混合标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化。2)样品提取在制备好的样品中，加入20ml提取溶剂(14ml乙腈+6tiil水)，进行微波萃取，将上清液移至鸡心瓶中，转速5000r/min离心2min，然后用2mol/LNaOH调pH至11-12，再用3ml乙酸乙酯萃取，上清液移至另一鸡心瓶中，重复一次，合并上清液。微波萃取条件温度8(TC;压力4.Oatm;时间8min。83)样品净化将上清液于6(TC旋转蒸干，用2ml浓度2%甲酸溶解，过OasisMCX小柱后(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脱，弃去；再用2ml浓度8%的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇与水的比例为30:70)洗脱，弃去；最后用2ml体积百分含量为8%氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮气吹干，用流动相定容至lml，过0.22Mm微孔滤膜，上机。4)液相色谱条件同实施例1;5)质谱条件同实施例1。3.实验结果1)方法的回收率和精密度对添加了1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺标准溶液的饲料进行重复性试验。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表6。表6两种药物的回收率和精密度(n二6)组分添加浓度(mg/kg)回收率平均值(％)变异系数(％)盐酸克伦特罗1.081.55.92.081.95.74.083.25.0莱克多巴胺1.072.14.12.073.25.54.073.95.92)方法的检出限根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检出限分别为l叫g/kg和10Pg/kg。<实施例3>1.实验仪器与试剂如下1)实验仪器同实施例1;2)实验试剂同实施例1;2.实验方法如下1)加标样品制备准确称取5.0g粉碎好的词料于聚四氟乙烯微波萃取罐中，分别加入浓度为1.0rag/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺混合标准工作液，开口静置过夜，待工作液中溶剂完全挥发，然后按照样品处理步骤进行提取和净化。2)样品提取在制备好的样品中，加入45ml提取溶剂(31.5ml乙腈+13.5ml水)，进行微波萃取，将上清液移至鸡心瓶中，转速5000r/min离心5min，然后用2mol/LNaOH调pH至11-12，再用7ml乙酸乙酯萃取，上清液移至另一鸡心瓶中，重复一次，合并上清液。微波萃取条件温度IO(TC;压力6.0atm;时间12min。3)样品净化将上清液于6(TC旋转蒸干，用2ml浓度2%甲酸溶解，过OasisMCX小柱后(OasisMCX小柱先用2ml甲醇活化，再用2ml水平衡)，用2ml甲醇洗脱，弃去；再用2ml浓度8X的氨水溶液(氨水溶液中的甲醇与水的比例为30:70)洗脱，弃去；最后用2ml体积百分含量为8%的氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮气吹干，用流动相定容至lral，过0.22Wn微孔滤膜，上机。4)液相色谱条件同实施例1;5)质谱条件同实施例1;3.实验结果l)方法的回收率和精密度对添加了1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg盐酸克伦特罗和莱克多巴胺标准溶液的饲料进行重复性试验。每个浓度取3份平行样，根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表7。表7两种药物的回收率和精密度(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2)方法的检出限根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检出限分别为lWg/kg和8Pg/kg。如图所示图1为2种药物标准色谱图。图2为2种药物标准质谱图。图3为添加浓度1.0mg/kg的饲料样品的色谱图。图4为方法标准曲线图。标准工作曲线的制备如下将浓度在0.25l^g/ml4.(￥g/ml的2种e-类兴奋剂的混标注入液质联用仪，以标准工作曲线样品峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，可得标准工作曲线。结果分析-盐酸克伦特罗和莱克多巴胺在动物性产品中的残留，可通过食物链进入人体，对人体具有明显的急慢性毒性，严重的可能危及生命。目前，分别检测盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等。但是，高效液相色谱法检测灵敏度低，难以达到规定的最低检测限；气相色谱-质谱联用法需要对样品进行衍生化，实验过程复杂；酶联免疫法仅针对尿样中的P-类兴奋剂进行检测，应用具有一定的局限性。从上述结果可知本实验建立的液质联用测定饲料中6-类兴奋剂的方法，采用微波萃取法进行样品前处理，只需要10min，与以往采用的超声波提取方法所需30min相比，縮短了提取时间，提高了提取效率；另外采用超高压液相色谱进行检测，只需要3min，大大縮短了传统的液相色谱检测所需的时间(15min);而且最低检测限分别达到了8Pg/kg和5J^g/kg,与液相色谱捡测相比降低了很多(液相色谱检测的最低检测限分别是125l^g/kg、10(￥g/kg);同时方法的回收率及精密度均达到残留分析的要求，适合用于饲料中3-类兴奋剂的分析。本方法的建立为解决如何更快、更精确地检测类兴奋剂的残留找到了一条新的途径，相信在这个平台上我们将会研究出更多新的方法，以解决目前在兽药残留检测领域中所存在的问题和不足。权利要求1.一种β-类兴奋剂的液质联用测定方法，其特征在于它包括下列步骤A、样品提取在样品中加入20～45ml提取溶剂，采用微波萃取法提取样品中的目标物，微波萃取温度在80～100℃，压力为4.0～6.0atm，时间为8～12min，然后以转速5000r/min离心2～5min，用2mol/LNaOH调pH至11～12，得一次上清液；再用3～7ml乙酸乙酯萃取，重复萃取条件一次，得二次上清液，合并两次上清液；提取溶剂为水和乙腈，水和乙腈的体积比为70∶30；B、样品净化将A步骤合并后的上清液于60℃旋转蒸干，用2ml浓度2％甲酸溶解，过OasisMCX小柱，先用2ml浓度100％的甲醇洗脱，弃去；再用2ml浓度8％的氨水溶液洗脱，弃去，氨水溶液中的甲醇与水的比例为30∶70；最后用2ml体积百分含量为8％的氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮气吹干，用流动相定容至1ml，过0.22μm微孔滤膜，上机；C、液相色谱检测条件是色谱柱为ACQUITYUPLCTMC18柱，规格为2.1mm×50mm×1.7μm，流动相为4mmol/L乙酸胺-乙腈，乙酸胺与乙腈的体积比为80∶20，流速为3ml/min，进样量为5μl，柱温为室温；D、质谱检测条件是采用电喷雾离子源，负离子多反应检测扫描；雾化器压力为30psi；干燥气流速为7.5L/min；扫描范围为190～300m/z，加热温度35℃。全文摘要本发明公开了一种快速、准确的β-类兴奋剂的液质联用测定方法。它包括微波萃取法进行样品前处理、超高压液相色谱检测和质谱检测步骤，微波萃取的样品前处理方法，具有理想的回收率和准确度；超高压液相色谱测定方法中的流动相为4mmol/L乙酸胺∶乙腈＝80∶20；质谱检测中的干燥器流速为7.5L/min。所用流动相具有一定的pH缓冲能力，因此pH不易变化，从而保证了分析结果的重复性和重现性，同时由于超高压液相色谱的柱效高，因而灵敏度高，检测速度快，节省检测时间。文档编号G01N30/00GK101603954SQ200910117350公开日2009年12月16日申请日期2009年7月4日优先权日2009年7月4日发明者刘彩云,唐守嵘,张文齐,慕婷婷,赵昊星,邵建宁,麻和平申请人:甘肃省科学院生物研究所