专利名称：沙眼衣原体感染定量检测荧光pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测沙眼衣原体感染 的荧光PCR (聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术：
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)为革兰阴性病原体，是一种严格的专性 细胞内寄生的微生物。沙眼衣原体是常见的性传播疾病、非淋菌性尿道炎的主要病原体，它 不仅会导致阴道、尿道的感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆 腔结构，导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。由于沙眼衣原体感染后无特异性临床表现，因 此实验室检查十分重要。荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方 法涉及的是iTaqman探针技术。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一 3’ 酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互 先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行， 5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出 荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四 氯-6-羧基荧光素)，JOE 0，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基荧光素)，HEX (六氯-6-甲基荧 光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或 DABCYL(4-(4’ -恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。
发明内容
为克服传统方法(如电泳法等)对CT检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成 本低并且能够作定量检测的检测产品。技术方案如下一种沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性参考 品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反 应液包括PCR扩增引物、特异性荧光探针。所述的阳性参考品和阳性工作标准品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T 载体质粒，所述插入的特异序列如下CTGTTTGCAAACTGTTCATCGCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGGTTTTAAAAAATGTTCGACTATTTT CTTGTTTAGAAGGTTGCGCTATAGCGACTATTCCTTGAGTCATCCTGTTTAGGAATCTTGTTAAGGAAATATAGCTT GCTGCTCGAACTTGTTTAGTACCTTCGGT 175bp0所述的阳性参考品为存放浓度为1. OX IO6-L OX IO7拷贝/毫升的重组质粒。
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所述阳性工作标准品分别为存放浓度为5. 0X104、5. 0X105、5. 0X106、5. OXlO7 拷贝/毫升的重组质粒。所述的阴性参考品为CT阴性血清。所述的PCR扩增引物序列如下扩增检测沙眼衣原体的正向引物 GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG 25bp ；扩增检测沙眼衣原体的反向引物 GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA 26bp0所述的特异性荧光探针序列如下检测沙眼衣原体的探针GCGACTATTCCTTGAGTCAT 20bp。所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可 以是FAM、ΤΕΤ、JOE、VIC、HEX、ROX, TAMRA, CY3、CY5 ；3，端的为一种荧光淬灭基团，可以是 TAMRA、DABCYL、BHQO、BHQ1、BHQ2。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基 团可以为一种或者两种。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优 点，结果直观，能实时监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不 需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险；②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特 异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时；④步骤简单；⑤可同时进行高通量的样本检测。总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在 两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取 代传统细胞检测或者普通PCR检测进行CT的早期诊断。
图1为CT阳性参考品的荧光PCR扩增曲线曲线为阳性参考品曲线，阴性参考品 曲线；图2为CT临床样本的荧光PCR扩增曲线所测得的四个阳性工作标准品Ct值在 19 31之间，阴性参考品Ct值为Undet,阳性样本Ct值在20 38之间。
具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂 商所建议的步骤和条件。实施例1 试剂盒的制备1.引物和探针设计与合成使用I^rimer Express 3. 0，针对CT的基因筛选处于保守区的引物，在选择好的引物基础上设计CT的探针。引物与探针均委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯 化，探针为HPLC纯化，探针5，端标记FAM荧光基团，3，端标记TAMRA荧光基团。扩增序列如表1 表1.特异性探针与引物序列
序列名称寡核苷酸序列(5’ -3’ )碱基长度(bp)CT探针GCGACTATTCCTTGAGTCAT20CT正向引物GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG25CT反向引物GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA262. CT质粒阳性模板的制备本实施例中CT质粒作为阳性模板用于制备阳性参考品和阳性工作标准品。使用步骤1中合成的扩增CT特异性引物扩增CT基因区靶序列，将经过纯化的PCR 产物连接到购自TAKARA公司的PMD18-T载体上；然后转化至购自天根生化科技(北京)有 限公司的大肠杆菌DH5ci感受态细胞中；通过蓝白斑筛选，构建MG重组质粒DNA作为阳性 参考品。构建的CT重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，并保 存于-20°C。3.参考品选择使用无沙眼衣原体的阴性血清作为阴性参考品；含有沙眼衣原体基因的重组质粒 (1. OX IO6-L OX IO7拷贝/微升)为阳性参考品。4.阳性工作标准品的制备使用含有沙眼衣原体基因浓度分别为5. OX 104、5. OX 105、5. OX 106、5. OX IO7拷 贝/毫升的重组质粒为阳性工作标准品。5.荧光PCR反应液组成表2. PCR反应液组成
原料名称工作浓度PCR BufferIXMgCl22-5mMdNTP0. 1-0. 5mMCT引物0. 1-0. 50 μ MCT探针0. 1-0. 50 μ MUNG酶0. 05-IU
权利要求
1.一种沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括阳性工作标准品、 阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧 光PCR反应液包括PCR扩增引物、特异性荧光探针。
2.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品和阳性工作标 准品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下CTGTTTGCAAACTGTTCATCGCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGGTTTTAAAAAATGTTCG ACTATTTTCTTGTTTAGAAGGTTGCGCTATAGCGACTATTCCTTGAGTCATCCTGTTTAGG AATCTTGTTAAGGAAATATAGCTTGCTGCTCGAACTTGTTTAGTACCTTCGGT 175bp。
3.如权利要求1或2所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于所述的阳性参考品为存放 浓度为1. OX IO6-L OX IO7拷贝/毫升的重组质粒。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性工作标准品为存放浓度 分别为5. OX 104、5. OX 105、5. OX 106、5. OX IO7拷贝/毫升的重组质粒。
5.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于所述的阴性参考品为CT阴性血清。
6.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增引物序列如下 扩增检测沙眼衣原体的正向引物GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG 25bp ；扩增检测沙眼衣原体的反向引物GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA 26bp0
7.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针序列如下检测沙眼衣原体的探针GCGACTATTCCTTGAGTCAT20bp。
8.如权利要求1或7所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针为 Taqman探针，标记探针5，端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、ΤΕΤ、JOE、VIC、HEX、ROX, TAMRA、CY3、CY5 ；3，端的为一种荧光淬灭基团，可以是 TAMRA、DABCYL、BHQO、BHQ1、BHQ2。
全文摘要
本发明公开了一种用于沙眼衣原体感染定量检测的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阳性工作标准品、阳性参考品、阴性参考品、荧光聚合酶链式反应液、PCR扩增引物和特异性荧光探针、PEG沉淀液、裂解液。本发明包括以荧光PCR技术为基础的PCR体系，包含针对沙眼衣原体基因序列的正、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可以检测沙眼衣原体基因的核酸序列；可以简便快速地在临床样本中检测沙眼衣原体感染，特异性高。
文档编号G01N21/64GK102094076SQ20091020039
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东, 黎飒 申请人:上海裕隆临床检验中心有限公司