专利名称：：微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于化学成分定量检测技术范围的一种乙醇及还原糖含量的快速检测方法，尤其涉及是结合3，5-二硝基水杨酸(3，5-dinitrOSaliCyliCAcid，简称DNS)与还原糖的显色反映和重铬酸钾对还原糖及乙醇的氧化反应而建立的一种定量快速检测乙醇的新方法。
背景技术：
：乙醇浓度是燃料乙醇、酒类等微生物发酵中重要的过程参数，直接影响着发酵过程的优化调控以及发酵产物的质量和产量，发酵液中乙醇含量的快速准确测定是此类研究与生产的前提与基础。尽管目前乙醇检测方法较多，但是由于每种方法都存在较大的局限性，很难满足燃料乙醇、酒类发酵研究与生产过程中乙醇浓度检测的需要。目前测定乙醇浓度的方法有气相色谱法，化学方法，比重法等，气相色谱法仪器昂贵而不适应基层单位的普及。化学方法有曙红内酯吸光度法，刚果红显色法，重铬酸钾法等，此类方法是利用某种物质(曙红、刚果红、重铬酸钾)与乙醇之间发生颜色方应，通过测定产物在某特定波长下的光吸收值，利用外标法求出乙醇的浓度。这些方法仅仅适用于样品蒸馏后乙醇的测定，而微生物发酵液中成分较为复杂，如果直接用以上方法测定，样品中所含的其他物质将严重干扰测定结^o目前国内食品卫生检验方法多采用比重法。比重法在分析时须蒸馏，而样品蒸馏过程费时费工，需要较大的样品体积，难以高通量检测多个样品。而且蒸馏过程一方面常常伴有乙醇的挥发，另一方面难以将样品中的乙醇完全蒸馏出来，所测结果准确性较差。为了促进燃料乙醇发酵工作的研究开发，为了便于跟踪发酵过程、评估不同发酵条件的效应，目前迫切需要一种能够直接从微生物发酵液中快速检测乙醇含量的方法，并以此方法建立相应的快速检测试剂盒。
发明内容本发明专利针对现有技术的不足，提供了一种直接从微生物发酵液中检测乙醇含量的定量检测新方法，这一方法根据重铬酸钾对还原糖及乙醇的都能进行氧化反应的特点，通过DNS对还原糖的氧化反应计算出还原糖含量，扣除其在重铬酸钾中的反应信号，从而得出样品中乙醇的含量，所以此方法也被称之为“还原糖扣除乙醇测定法”。为实现以上目的，本发明专利采用的技术方案是1.对微生物发酵液进行预处理离心去除发酵液中的不溶性物质，然后用三氯乙酸去除发酵液中的蛋白质，再利用十六烷基三甲基溴化胺(HexadecyltrimethylammoniumBromide，简称CTAB)去除发酵液中的多糖，如此处理后的样品中所含有的主要成分为乙醇和少量还原糖。2.用3，5_二硝基水杨酸建立还原糖标准曲线并检测样品中的还原糖含量3，5-二硝基水杨酸和还原糖的颜色反应可以通过读测A550光吸收检验，根据还原糖在3，5_二硝基水杨酸处理下的标准曲线将样品中的还原糖准确定量。3.用重铬酸钾建立还原糖标准曲线并检测样品重铬酸钾属于强氧化剂，既可以与样品中的还原糖又可以和其中的乙醇发生氧化反应，其氧化产物可以通过读测0D585光密度检验。因此可以首先通过上述(2)描述的DNS方法计算出样品中的还原糖含量，再根据重铬酸钾的还原糖标准曲线，计算出样品中还原糖在重铬酸钾总氧化反应信号中所占的部分。4、用重铬酸钾建立乙醇标准曲线并计算样品中乙醇含量从重铬酸钾总氧化反应信号中减去还原糖与重铬酸钾反应所占的部分，得出重铬酸钾与样品中乙醇反应的信号强度，根据乙醇与重铬酸钾反应的标准曲线，计算出样品中乙醇的浓度。本发明方法中所说的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法的试剂盒，用于上述所述的应用领域，包括样品预处理所需试剂、还原糖检测反应试剂、重铬酸钾氧化反应试剂、还原糖标准品、乙醇标准品、反应终止液、微孔板、用法说明等。需要进步一说明的是本发明方法中所说的微生物发酵液主要是指由真菌(包括酵母)、细菌(包括运动发酵单胞菌)、真菌或细菌提取液、真菌或细菌发酵酶系统产生的任何含有乙醇的发酵液或反应液，发酵所用的营养物质主要是指农产品粗加工材料，也可以是组分明确的培养基。本发明方法中所说的还原糖是指含有半缩醛或半缩酮结构、能够还原斐林试剂的糖，以葡萄糖为代表，其中所说的还原糖标准溶液通常采用葡萄糖配制，但是也可以采用其他单一的还原糖或不同还原糖的混合物配制。本发明方法中所说的检测还原糖的方法是利用还原糖具有还原性的特点而对其进行检测。本发明方法中所说的检测还原糖的方法最好为DNS方法，但也可以是其他方法。本发明方法中所说的定量检测方法，在检测微生物乙醇发酵结果、跟踪发酵进程、鉴定不同发酵条件的效应等方面的应用，应用领域包括乙醇发酵原理和发酵工艺的探索、饮用乙醇类产品的研发生产、工业乙醇类产品的研发生产、燃料乙醇类产品的研发生产等。本发明专利所说的试剂盒还原糖检测反应试剂为3，5-二硝基水杨酸试剂。本发明方法中所说的还原糖是指含有半缩醛或半缩酮结构、能够还原斐林试剂的糖，以葡萄糖为代表。本发明专利公开了在微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，不需要精密的检测仪器，就能直接从微生物发酵液中检测乙醇的含量，方法简便灵敏度高、特异性好、快速简便，高通量、尤其适用于同时检测多个样品。本方法除了检测乙醇浓度，同时也连带得到发酵液中还原糖的浓度。这一方法能够广泛应用在检测微生物乙醇发酵结果、跟踪发酵进程、鉴定不同发酵条件的效应等方面。根据这一方法的原理，能够开发、生产、调配和包装相应的检测产品，包括完整试剂盒和试剂盒的组成部分。图1为DNS法制备葡萄糖标准曲线图；图2为重铬酸钾法制定葡萄糖标准曲线图3为重铬酸钾法制定乙醇标准曲线图；具体实施例方式下面以实施例具体说明本专利检测步骤1、配制DNS和重铬酸钾溶液DNS溶液将6.3g的3，5_二硝基水杨酸和262mL的2molNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至lOOOmL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。重铬酸钾溶液用8N的硫酸使重铬酸钾饱和。2、配制乙醇和葡萄糖标准样液乙醇标准样液将4mL无水乙醇加入96mL纯净水中配制成4%溶液，然后用纯净水将其进行2倍系列稀释至2%、1%、0.5%、0.25%,0.125%,0.0625%,0.03125%,0.015625%,0.007813%的乙醇溶液。葡萄糖标准样液称取80°C烘干至恒重的分析纯葡萄糖lOOmg，加入纯净水溶解定容至100mL，然后用纯净水配制成2.5%U.25%,0.625%,0.3125%,0.15625%的标准葡萄糖溶液。3、制作标准曲线(l)DNS法葡萄糖标准曲线取上述标准葡萄糖溶液每个浓度200iiL，加600iiLDNS,100°C加热lOmin,用流水冲洗至冷却，取200yL于96孔板中，在550nm下测0D值，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果见图1(2)重铬酸钾法葡萄糖标准曲线取上述标准葡萄糖溶液每个浓度溶液60yL，加入120iiL的重铬酸钾溶液，室温反应30min后，在585nm下读测0D值，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果见图2。(3)重铬酸钾法乙醇标准曲线取上述标准乙醇溶液每个浓度60uL，加入120uL的重铬酸钾溶液，室温反应30min后，在585nm下读测0D值，以光密度值为纵坐标，乙醇浓度(％)为横坐标，绘制乙醇标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果见图3。4、制备微生物发酵液配制发酵培养基，高压蒸汽灭菌后按照10%的接种量接种。在适宜的温度下发酵24h以后取lmL发酵液。5、预处理发酵液样品将lmL发酵液室温12000rpm离心5min，取0.5mL上清液，加入等体积的20%的三氯乙酸静置30分钟，室温13000r/min离心lOmin，取上清液，若上清液存在悬浮物质，可通过细菌滤器再次过滤。然后加入200yL的CTAB溶液，65°C水浴lOmin，室温13000r/min离心lOmin，取上清液，并将获得的样品稀释10倍，然后检测。6、DNS法测定样品中的还原糖从处理好得样品中取200yL经稀释10倍的上清液于离心管中，加入600uLDNS溶液，混勻，100°C下加热lOmin，用流水冲洗至冷却，取200yL于96孔板中，在550nm下测0D值。采用实际数据，计算样品中的还原糖浓度。7、重铬酸钾氧化法测定样品从处理好的样品中取60PL经稀释10倍上清液于96孔板中，加入120iiL重铬酸钾溶液，混勻，室温下反应30min，在585nm下测吸光度。采用实际数据，计算样品的重铬酸钾氧化反应总体0D585数值。8、计算还原糖在发酵液重铬酸钾氧化反应中所占的信号强度(0D585数值)根据重铬酸钾法葡萄糖标准曲线，将样品中的还原糖浓度转换为重铬酸钾氧化反应的0D585数值。(采用实际数据，计算样品中还原糖的重铬酸钾0D585数值)9、计算样品中的乙醇浓度用样品的重铬酸钾氧化反应总体0D585数值减去样品中还原糖的重铬酸钾0D585数值，得出样品中乙醇的重铬酸钾0D585数值。然后根据重铬酸钾法乙醇标准曲线，计算得出样品中的乙醇浓度。10、验证本方法结果通过蒸馏法或其他方面检测该样品中乙醇的含量，比较结果。为了验证本检测方法的准确性，我们将甘薯乙醇发酵的发酵液按照本专利的方法进行预处理，(标记为0号)。取0号液体2mL加入不同体积的无水乙醇，获得13个不同乙醇浓度的样品(标记为1-13)，然后使用本方法检测其中的乙醇浓度，结果见表1，由表可知RSSEA法用于检测发酵液中的乙醇浓度准确可靠。表1乙醇测量值与真实值的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明专利的实施过程是对传统的DNS检测还原糖方法、重铬酸钾检测还原糖方法、重铬酸钾检测乙醇方法进行了技术改进，使其具有使用样品量少、一次测定样品数多、测量准确快速等优点。权利要求微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的检测方法为(1)对微生物发酵液进行预处理离心去除发酵液中的不溶性物质，然后用三氯乙酸去除发酵液中的蛋白质，再利用十六烷基三甲基溴化胺去除发酵液中的多糖，如此处理后的样品中所含有的主要成分为乙醇和少量还原糖。(2)用3，5-二硝基水杨酸建立还原糖标准曲线并检测样品中的还原糖含量3，5-二硝基水杨酸和还原糖的颜色反应可以通过读测A550光吸收检验，根据还原糖在3，5-二硝基水杨酸处理下的标准曲线将样品中的还原糖准确定量。(3)用重铬酸钾建立还原糖标准曲线并检测样品利用样品中还原糖含量，根据重铬酸钾还原糖标准曲线，计算出样品中还原糖在重铬酸钾总氧化反应信号中所占的部分。(4)用重铬酸钾建立乙醇标准曲线并计算样品中乙醇含量从重铬酸钾总氧化反应信号中减去还原糖与重铬酸钾反应所占的部分，得出重铬酸钾与样品中乙醇反应的信号强度，根据乙醇与重铬酸钾反应的标准曲线，计算出样品中乙醇的浓度。本发明专利试剂盒试剂包括样品预处理所需试剂、还原糖检测反应试剂、重铬酸钾氧化反应试剂、还原糖标准品、乙醇标准品、反应终止液、微孔板。2.根据权利要求1所述的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的微生物发酵液主要是指由真菌、细菌、真菌或细菌提取液、真菌或细菌发酵酶系统产生的任何含有乙醇的发酵液或反应液，发酵所用的营养物质主要是指农产品粗加工材料，也可以是组分明确的培养基。3.根据权利要求1所述的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的还原糖是指含有半缩醛或半缩酮结构、能够还原斐林试剂的糖，以葡萄糖为代表，其中所说的还原糖标准溶液通常采用葡萄糖配制，但是也可以采用其他单一的还原糖或不同还原糖的混合物配制。4.根据权利要求1所述的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的检测还原糖的方法为3，5-二硝基水杨酸方法。5.根据权利要求1所述的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还原糖检测反应试剂为3，5-二硝基水杨酸试剂。6.根据权利要求1所述的微生物发酵液中乙醇含量的快速检测方法及试剂盒，其特征在于所述的还原糖是指含有半缩醛或半缩酮结构、能够还原斐林试剂的糖，以葡萄糖为代表。全文摘要本发明公开了属于化学成分定量检测技术范围的一种乙醇及还原糖含量的快速检测方法，其步骤包括对微生物发酵液进行预处理，用DNS建立还原糖标准曲线并检测样品中的还原糖含量，用重铬酸钾建立还原糖标准曲线并检测样品，用重铬酸钾建立乙醇标准曲线并计算样品中乙醇含量，本发明不需要精密的检测仪器，就能直接从微生物发酵液中检测乙醇的含量，具有精确度高、操作快速简便、需用的样品量及试剂量少、成本低、需用的仪器设备少、对环境的要求低，检测过程不产生污染，一次检测的样品数多等优点。文档编号G01N21/78GK101825576SQ20091022588公开日2010年9月8日申请日期2009年11月30日优先权日2009年11月30日发明者丁铁林,孙东旭,张鹏,陈才法申请人:无锡灵特生物技术有限责任公司