专利名称：一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物制品活性检测技术领域，具体涉及一种重组人p43蛋白生物学活 性的检测方法。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌，医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌细胞 为主的方法，即手术治疗、化疗、放疗等。这些方法在杀死癌细胞的同时也损伤正常细胞， 并且容易使肿瘤细胞产生耐药性。因而，人们一直在探索一种能专一性地杀死肿瘤细胞且 不损伤正常细胞，同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方法。目前用于治疗肿瘤的新药不 断涌现。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶 性肿瘤的方法。传统的肿瘤化疗大多使用细胞毒性药物，在杀死肿瘤细胞的同时也对正常 细胞造成损害，削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。 恶性肿瘤有一个共同的特性，那就是局部的细胞疯狂地、不受遏制地增殖，而维持这种增殖 就意味着需要大量营养供应。在肿瘤形成的同时，瘤体的内部及周围会形成大量供应养分 的血管。那么如果能切断这些供养“管道”，阻断肿瘤的营养来源，肿瘤也就会衰竭而死。当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底治疗肿瘤带来了曙光。研究发现肿瘤特别 是实体瘤的生长需要大量的营养供应，在肿瘤周围会形成大量的新生血管。抗血管生成疗 法主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增 殖，从而阻止肿瘤血管生成，使肿瘤毛细血管发生萎缩，切断肿瘤的营养供应，使肿瘤细胞 凋亡或退化到最初的休眠状态，从而达到治疗癌症的目的。经过近十年的不断努力，现在已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血 管抑制剂。其中最具代表性的是人血管内皮抑制素(human endostatin) 0有关人血管内 皮抑制素(Endostatin)国际上首先报道是1997年1月Cell杂志上刊登的美国哈佛医 学院福尔克曼(Folkman)研究小组关于鼠内皮抑素基因的论文，该研究发现Angiostatin 和Endostatin可以消除小鼠体内恶性肿瘤，而且未再复发。这两种药物是以阻止为肿瘤 提供营养的血管的生长从而治疗肿瘤的。当时引起了国际轰动，Endostatin迅速成为肿 瘤治疗领域的研究热点。美国FDA在没有完成临床前研究的情况下特批30例对其它药物 已无反应的晚期癌症病人于99年初用人血管内皮抑制素(Angiostatin)和鼠内皮抑素 (Endostatin)混合基因工程针剂进行临床试验。目前，Endostatin已经通过了 FDA的一期 临床，目前正处于二期临床阶段。但由于Endostatin的溶解性较差，使得它的制备成本升 高，同时在使用上也只能采用水针剂型，这使它的应用受到了很大的限制。p43蛋白是哺乳动物氨酰tRNA合成酶的辅助因子，一方面直接调节内皮细胞形成 毛细血管的生理过程，另一方面P43也受到上游细胞因子的作用而从多种细胞中分泌，进 一步活化巨噬细胞和树突细胞，从而抑制肿瘤生长。P43蛋白的抗血管生成活性及抑制肿瘤 生长作用已经在体外及动物实验获得证实。人基因重组P43蛋白显示出其被开发成新型治 疗癌症药物的潜力，对抗多种原发性和转移性实体肿瘤均有效，并可与化疗和放疗协同治疗。p43蛋白作为人体氨酰tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活肽的 前体于1997年被Sophie Q等人发现。p43蛋白为单链蛋白，全长312个氨基酸。韩国 Imagene公司(W001/95927)对人p43蛋白的结构、生物活性进行了深入的研究，结果显示 人P43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，以及抑制鸡胚尿囊膜新生血管 生成，这说明P43蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。定性和定量地测定重组人p43蛋白的生物学活性对于该药物的研发具有重要意 义。目前血管生成抑制类药物的生物学活性测定还没有很好的解决办法，现有测定方法的 原理主要建立在该类药物调节血管生成相关生理功能的基础上，具体实验方法包括体外的 内皮细胞迁移试验、内皮细胞增殖试验和体内的鸡胚尿囊膜血管生成试验、小鼠肿瘤抑制 试验、Matrigel试验以及角膜新生血管生成试验。经研究，现有的这些测活方法均存在重 复性较差，人为及实验材料影响因素较大，操作较难控制等问题。因此，目前急需一种能够准确测量重组人p43蛋白生物学活性的方法和产品。
发明内容
本发明依据活性状态下的p43蛋白具有诱导小鼠单核巨噬细胞RaW64. 7分泌 TNFa的功能，进而通过研究确定重组人p43蛋白与诱导产生TNF α间的量效关系，提供一 种简便、精确、快速定性和定量测定重组人P43蛋白的生物学活性的方法。本发明一方面提供了一种测定重组人P43蛋白的生物学活性的方法，本发明提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下 步骤(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞RaW64. 7，产生TNFa ；(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFa含量；(3)根据步骤(2)得到的TNFa含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。在本发明的一个优选实例中，所述步骤(1)中的诱导方法包括用缓冲液梯度稀释 待测样品，并作出不少于五个稀释度，再将稀释液分别与小鼠单核巨噬细胞混合孵育培养。在本发明的一个优选实例中，所述缓冲液是无血清DMEM培养基。在本发明的一个优选实例中，所述酶联免疫法是双抗夹心法。在本发明的一个优选实例中，所述步骤C3)是根据《中华人民共和国药典》2005年 版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行的。在本发明的一个优选实例中，所述步骤(3)如下进行以p43浓度的对数值IgCp43 为X值，以相应的TNFa浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得到重组人 P43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到四参数分析结果。在本发明的一个优选实例中，由所述步骤(3)得到的能诱导50%最大反应的重组 人P43蛋白最高稀释度的倒数作为活性值。本发明还提供了一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括本发明所述的测量 重组人P43蛋白的生物学活性的方法。本发明利用活性状态下的p43具有活化免疫系统的功能性反应以进行p43生物学 活性测定，具有特异强、反应快速、重复性好，并能定量反应P43生物学活性的优点。
附图简述
图1为实施例1中重组人p43蛋白样品促进小鼠单核巨噬细胞Raw264. 7分泌 TNFa的剂量-效应S型曲线。
具体实施例方式在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％ )或者份都指相对于组合物的重量 百分数或者重量份。在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合 形成新的技术方案。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可 以相互组合形成新的技术方案。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100%。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量 份。在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了 “0-5” 之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组 合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“ 1-N”表示1、2……N，其中N是 整数。在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两 种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组 合物的总重量。本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个 或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限 定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限 可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60-120和80-110的范围， 理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如 果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2_5。在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。在本文中，除非另有说明，所述“生物学活性”是按照《生物技术药物研究开发和质 量控制》第二版所述，以能诱导50%最大反应的样品的稀释度中所含样品量为1单位(U)。本发明一方面提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包 括以下步骤(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264. 7，产生TNFa ；
(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNF α含量；(3)根据步骤(2)得到的TNFa含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。虽然不希望受到理论的限制，但是通常诱导方法的机理是以一定浓度的p43蛋白 或者是其他物质加入到细胞培养基中，即以含有一定浓度P43的培养基来培养Raw263. 7细 胞，如果加入的p43具有生物学活性，则在一定的时间内能诱导Raw264. 7细胞分泌TNF α。 在本发明中，上述步骤(1)中的诱导方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的 描述再结合其专业技术可以直接得到该诱导方法。具体的诱导方法可参见Park H, Park SG, Kim J, Ko YG, Kim S.Signalingpathways for TNF production induced by human a minoacyl-tRNAsynthetase-associating factor, p43. Cytokine.2002 Nov 24 ；20 (4) 148-53。在本发明的一个优选实例中，所述诱导方法包括以适用于细胞培养的缓冲液梯度稀释待测样品，并作出不少于五个稀释度，再将 稀释液分别与一定数量的特定细胞(例如小鼠单核巨噬细胞)混合孵育培养。在一定的优 化培养时间后，该细胞会产生可供检测的效应(例如TNF α )。在本发明中，上述步骤(2)中的酶联免疫法是常规的，本领域的普通技术人员根 据本发明的描述再结合其专业技术可以直接得到该酶联免疫法。虽然不希望受到理论的限 制，但是通常酶联免疫法依据的基本原理是抗原与抗体间的特异性反应，其基本方法是将 已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行。本发 明所述的酶联免疫法可包括但不限于双抗夹心法。所述双抗夹心法可包括例如将特异性抗 体(抗TNF α的抗体)与固相载体(酶标板)联结，形成固相抗体；洗涤除去未结合的抗体 及杂质；加待检样品(含有TNFa的细胞培养上清液)，保温反应；样品中的抗原(TNFa) 与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；洗涤除去其他未结合物质；加酶标抗体(酶标 记的抗TNF α抗体)，保温反应；固相免疫复合物上的抗原(TNFa)与酶标抗体结合(酶标 记的抗TNF α抗体)；彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受 检抗原的量相关；加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。颜色的深浅和样品中 的目标蛋白呈正相关。通过比色可测知标本中抗原的量。在本发明中，通过TNF α含量得到重组人ρ43蛋白的生物学活性的方法是常规的， 本领域的普通技术人员根据其专业知识可以直接得到具体的方法。具体的测试方法可参见 例如《中华人民共和国药典》2005年版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版 进行。例如，按照《中华人民共和国药典》2005年版三部要求，采用GraphPad Prism软件进 行处理。根据检测结果，以P43浓度的对数值IgCp43为X值，以相应的TNF α浓度为Y值， 采用Nonlinear regression曲线拟合，得到重组人p43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到 四参数分析结果。样品的生物学活性按照《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版所 述，用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价(或滴度)，也可将此稀释 度中所含的细胞因子的量作为1个活性单位(U)，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的 单位数。本发明还提供了一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括本发明所述的测量 重组人P43蛋白的生物学活性的方法。实施例实施例1L重组人D43蛋白成品的制备1. 1 材料20%甘露醇，上海百特医疗用品有限公司；超滤器及0. 22 μ m无菌滤器为PALL公 司产品；生物安全柜品牌为Heraeus，型号为KS12 ；-70°C低温冰箱品牌为Thermo，型号为 HETO ULTRA FREEZE UF5410 ；冻干机品牌为 Thermo，型号为 Heto Lyolab3000。1. 2 方法以pH7. 4的磷酸盐缓冲液PBS对纯化后的重组人p43蛋白原液(p43蛋白原液的 制备方法参见CN101225371A)进行超滤透析，加入20%甘露醇，甘露醇的终浓度为5%，所 得溶液经0. 22 μ m无菌滤器过滤除菌，分装于2ml体积无热源西林瓶中，将分装的半成品 置-70°C预冻12小时，预冻好的半成品放入冻干机中，在_50°C冻干，冻干时间为24小时， 冻干后成品于无菌条件下加塞、随后压盖、贴标签。制剂规格为4mg/支的p43样品。2.样品检测2. 1检测步骤2. 1. !Raw264. 7 细胞培养2. 1. 1. 1 材料小鼠单核巨噬细胞RAW264. 7，购自中国科学院上海生命科学研究院；DMEM高糖、 胎牛血清(FBS)、青霉素链霉素双抗、PBS及TryPLE Express为Invitrogen，GIBCO产品； 25cm2细胞培养瓶为Corning公司产品；CO2细胞培养箱品牌为Heraeus，型号为HERAcell 150 ；生物安全柜品牌为Heraeus，型号为KS12。2. 1. 1. 2 方法Raw264. 7细胞以10% FBS DMEM的培养基(完全培养基)培养，培养条件为5% C02，37°C培养箱；细胞呈贴壁生长，隔天更换完全培养基，待培养瓶内细胞生长到约90%汇 合度，即可进行活性检测，各代次生长状态良好的细胞均可用于活性检测。2. L 2测活细胞接种至96孔板2. 1. 2. 1 材料96孔细胞培养板为Corning公司产品；血球计数板购自上海求精生化试剂仪器有 限公司；倒置显微镜品牌为Olympus，型号为1X51。2. 1. 2. 2 方法以PBS洗涤约90 %汇合度且状态良好的细胞，加TryPLE Express消化液于室温消 化细胞，镜下观察消化进程，待细胞回缩变圆时以完全培养基终止消化，以吸管吹打混勻细 胞，镜下计数，用完全培养基稀释细胞到lX105/ml。以100μ I/well接种，在5% CO2, 37 °C 培养箱内静置培养4小时。2. 1.3样品稀释加药2. 1. 3. 1 材料阳性对照脂多糖LPS(E. Coli 0111 :B4)购自Sigma,以无血清DMEM培养基稀释 至80 μ g/ml，分装冻存于_70°C ；阴性对照以无血清DMEM培养基稀释p43样品至2000 μ g/ ml，沸水浴变性5min ；空白对照无血清DMEM培养基；20 μ 1、200 μ 1、1000 μ 1移液器枪头，1. 5ml离心管均为Axygen公司无菌无热源产品；移液器为Gilson公司产品。2. 1. 3. 2 方法1)细胞接种至96孔板约3小时后，以无血清DMEM培养基稀释p43样品、阴性及 阳性对照:p43 样品平行稀释至 4000ug/ml、2000y g/ml、500y g/ml、125y g/ml、31. 25 μ g/ ml、15. 625μ g/ml、7. 8125μ g/ml、3. 90625 μ g/ml 八个浓度；阴性对照含 2000 μ g/ml 沸水 浴变性P43样品；阳性对照含0. 8 μ g/mlLPS ；以无血清DMEM培养基做空白对照。2)将完全培养基和上步制备的各组样品按7 1比例稀释混合，使得p43样 品的终浓度为 500μ g/ml、250 y g/ml、62. 5μ g/ml、15. 625μ g/ml、3. 90625μ g/ml、 1. 953125 μ g/ml,0. 9765625 μ g/ml、0. 48828125 μ g/ml，阴性对照的终浓度为 250 μ g/ml, 阳性对照的终浓度为0. 1 μ g/ml。3)吸弃96孔板内原培养基，以每孔150 μ 1体积加入稀释后各样品，每组设三个复 孔，在5% C02、37°C培养箱内静置培养18小时。2. 1.4培养上清中TNF α含量检测2. 1. 4. 1 材料Mouse TNFa Elisa Kit为上海依科赛生物制品有限公司产品；手动八通道排枪 为HTL公司产品；生化培养箱品牌为Heraeus，型号为BK-600 ；酶标仪品牌为Thermo，型号 为 Multiskan Spectrum。2. 1. 4. 2 方法1)药品处理细胞18小时后，取各组每组各三个孔中培养液混合并离心取上清待 用，后操作均依照Mouse TNFa Elisa试剂盒说明书。2)取出ELISA试剂盒，平衡至室温，并混勻各试剂。3)稀释TNF α标准品取Iml试剂稀释液加至1支冻干TNF α标准品中，静置15分 钟以充分溶解并混勻，得2000pg/ml起始管，随后对半稀释标准品至终浓度为1000pg/ml， 500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62. 5pg/ml，31. 25pg/ml，同时取试剂稀释液做 Opg/mlTNF a 标准品。4)以注射水稀释20X浓缩洗涤液。5)以每孔100 μ 1体积分别加入第3步稀释的标准品及第1步收集的样品，每组样 品设三个复孔，薄膜封板，37°C孵育90分钟。6)以1 1000比例用稀释液稀释浓缩生物素化抗体。7)洗板5次，每次340 μ 1洗涤液。8)每孔加100 μ 1第6步准备的生物素化抗体工作液，薄膜封板，37°C孵育60分 钟。9)以1 1000比例稀释液浓缩酶结合物。10)洗板5次，每次340 μ 1洗涤液。11)每孔加100μ 1第9步准备的酶结合工作液，薄膜封板，37°C孵育30分钟。12)洗板5次，每次340 μ 1洗涤液。13)每孔加100 μ 1显色底物，薄膜封板，37°C孵育15分钟。14)每孔加100 μ 1终止液，10分钟内于450nm波长测定光吸收，并通过酶标仪自 带软件且选择Quadratic Polynomial法绘制标准曲线。软件自动计算出各样品的TNF α浓度。2. 2结果检测结果如下表所示表1重组人P43蛋白样品诱导TNF α的检测结果
权利要求
1.一种测量重组人P43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞RaW64.7，产生TNFa ；(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；(3)根据步骤(2)得到的TNFa含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的诱导方法包括用缓冲液梯 度稀释待测样品，并作出不少于五个稀释度，再将稀释液分别与小鼠单核巨噬细胞混合孵 育培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是无血清DMEM培养基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶联免疫法是双抗夹心法。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是根据《中华人民共和国药典》 2005年版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)如下进行以p43浓度的对数 值IgCp43为X值，以相应的TNF α浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得 到重组人P43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到四参数分析结果。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，由所述步骤(3)得到的能诱导50%最大反 应的重组人P43蛋白最高稀释度的倒数作为活性值。
8.一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括权利要求1所述的测量重组人p43蛋 白的生物学活性的方法。
全文摘要
提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，产生TNFα；(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。本发明利用活性状态下的p43具有活化免疫系统的功能性反应以进行p43生物学活性测定，具有特异强、反应快速、重复性好，并能定量反应p43生物学活性的优点。
文档编号G01N33/68GK102109527SQ20091024721
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者刘大涛, 胡立德, 谭小钉, 黄相红 申请人:上海信谊药厂有限公司